Транспортер т4 фольц: Купить б/у Volkswagen Transporter T4 в Москве, продажа автомобилей Фольксваген Транспортер T4 с пробегом на сайте

Слабые стороны и недочеты Volkswagen Transporter T4

Микроавтобусы Фольксваген Т4 производили с 1990 по 2003 год. Благодаря надежности, удобству в эксплуатации и широкому ассортименту модельного ряда, автомобиль стал чрезвычайно популярным как в странах Европы, так и среди автомобилистов из СНГ. Вместе с огромным числом преимуществ Volkswagen T4 имеет некоторые недостатки и слабые места о которых должен знать будущий покупатель и обращать на них внимание при покупке.

Слабые места Volkswagen Transporter:

• кузов;
• двигатель;
• коробка передач;
• подвеска;
• раздвижная дверь.

Теперь подробнее…

Кузов.

В целом кузов у «Течика» очень прочный, изготовленный из оцинкованного металла. Однако данный материал восприимчив к длительному воздействию влаги. Значительное количество ржавчины на кузове встречается редко. Зато ржавое днище – явление очень распространенное. Коррозия часто поражает нижнюю часть дверей, пороги, водостоки и задние крылья авто.

Особенно уязвимы машины, которые долгое время эксплуатируются в условиях некачественных дорог, большого количества реагентов на дорогах зимой и влажного климата. Как проверить? Для проверки состояния кузова автомобиля необходимо произвести тщательный визуальный осмотр на эстакаде. Нужно подвергнуть поверхность кузова, особенно днища, легкому механическому воздействию руками, особенно на швах. И важно помнить, что данная модель (Т4) уже не выпускается и поэтому с ЛКП практически у всех машин проблемы.

Мотор.

Уязвимые места есть и у дизельных моторах, и у бензиновых. Для дизельных характерны периодические поломки топливного насоса высокого давления, системы управления накалом свечей. Для турбодизельных двигателей нередки поломки турбокомпрессора. У бензиновых моторов наиболее часты неисправности вспомогательного электрического оборудования: стартера, генератора, катушки зажигания и прочего.

Как проверить?

В первую очередь для проверки мотора необходимо измерить компрессию в цилиндрах при помощи специального прибора. Основные «симптомы» проблемного двигателя следующие:

1. автомобиль плохо заводится или не заводится вообще;
2. выхлопные газы синего или белого цвета;
3. масло на щупе с пеной либо с белыми или светло-синими вкраплениями;
4. охлаждающая жидкость в расширительном бачке грязно-коричневого цвета;
5. сторонние шумы при работе мотора;
6. плохая тяга.

Коробка передач.

Особенно проблематичны автоматические коробки передач. В них регулярно выходят из строя гидротрансформаторы. Но и в механических много проблем. Довольно быстро изнашиваются подшипники, шестерни. В результате переключение передач становится затруднительным. К слову, коробка передач считается одним из проблемных мест автомобиля Volkswagen Transporter 4. При проверке сначала нужно проверить количество и качество масла в КПП. Оно должно быть чистым, по уровню. Далее следует попереключать передачи, на месте и в процессе движения автомобиля. В исправном автомобиле передачи переключаются легко, плавно, без сторонних шумов, постукиваний.

Передачи не «выскакивают».

Подвеска.

Подвеска Фольксвагена Т4 достаточно прочная. Ее состояние зависит от условий эксплуатации автомобиля и качества дорог. В передней торсионной подвеске выходят из строя верхние шаровые опоры — 50 т.км., втулки стабилизаторов — 30 т.км., сайлент-блоки нижних рычагов прослужат чуть более 60 т.км.. Задняя пружинная подвеска — амортизаторы отходят 120 т.км. без фанатичной нагрузки. При проверке начинать следует с визуального осмотра. У неисправных деталей очень часто образовываются масляные потеки. Все резиновые составляющие должны быть целыми, без дефектов и трещин. Неисправная подвеска при езде создает характерные шумы.

Раздвижная дверь.

Поломка роликов боковой двери – довольно распространенная проблема и можно сказать болезнь Фольксваген Т4. На начальном этапе неисправности боковые двери закрываются плохо, не всегда с первого раза. Со временем дверь просто невозможно будет закрыть. В исправном состоянии она должна закрываться легко и сразу. Поэтому при покупке необходимо обратить на это внимание и несколько раз открыть и закрыть дверь.

Основные недостатки Фольксвагена Транспортер Т4:

• Дорогие запчасти;
• Рычаг переключения передач расположен далеко;
• Слабая шумоизоляция;
• Вибрация оконных рамок;
• Плохая оптика;
• Сверчки в торпеде;
• Слабый и долгий прогрев салона в зимнее время.

Заключение.

Исходя из вышеизложенного можно сделать вывод, что в общем автомобиль в свое время занимал среди своих конкурентов достойное место, но из-за возрастных параметров данных авто следует понимать, что кузов довольно сильно подвергся коррозии. Поэтому при выборе автомобиля необходимо сделать правильный выбор, вывод и обдумать все за и против. Ведь данным автомобилям на авторынке существует множество альтернатив.

Фольксваген Т4 — технические характеристики легенды

О том, каков он, овеянный легендами и знаменитый во всем мире автомобиль Фольксваген Т4, технические характеристики расскажут лучше всего. Здесь действительно есть, на что обратить внимание. Под скромной и вместе с тем привлекательной внешностью фургона скрываются большие технические возможности и сильный потенциал, не потерявший актуальности до сегодня. Создатели автомобильного шедевра, ведущие инженеры немецкой компании «VW», гордятся за свое творение до сих пор, несмотря на солидный возраст минивэна.

Коротко о главном

Как и все автомобили, произведенные под именем немецкого бренда vw, минивэн отличается превосходными характеристиками, которые дают ему возможность называться одним из наиболее надежных авто в своем сегменте. Владелец значка vw не может показывать слабость на дороге. Фольксваген транспортер т4 является последователем Kafer, ранее также сходившего с конвейера завода.

Во многом машине удалось заполучить популярность в мире благодаря сочетанию характеристик и привлекательного экстерьера. Дизайн автомобиля запоминается, хотя на протяжении долгих лет изменился незначительно, сохранив фирменное лицо. Машина имеет несколько модификаций – Multivan, California и Caravelle, каждая из которых заслуживает внимательного рассмотрения.

 

Впервые vw транспортер появился в 1950 году. Тогда дебютировавшему фургону позволила выделиться превосходная грузоподъемность – небывалая среди автомобилей подобного класса 860 килограммов. Спереди минивэн украшала фирменная эмблема автогиганта vw, а лобовое стекло было поделено на две части. Второе поколение появилось на свет в 1967 году, и большим сюрпризом для фанатов модели стало минимальное вмешательство дизайнеров в стиль машины.

Multivan

Около 70% выпущенных автомобилей Т2 пошли на экспорт в другие страны, благодаря чему о комфорте и надежности по-немецки узнали водители на разных континентах. Очередная генерация явила себя в конце 70-х годов. Автомобиль по-прежнему сохранил за собой стильный внешний вид, однако техническая составляющая заметно улучшилась: колесная база, общие габаритные размеры, грузоподъемность – все это увеличилось и стало лучше для решения многочисленных профессиональных задач.

Эффектное появление Т4

В четвертый раз в модели минивэна Фольксваген т4 изменились уже технические характеристики и дизайн. В обновленной конструкции стоит отметить переработанную трансмиссию. На этот раз решения инженеров компании были более радикальными – автомобиль лишили заднего привода, сменив его на передний. Более того, появились модели с полным приводом, что увеличивало технические возможности уже знаменитого на то время автомобиля.

Машина производится с несколькими типами кузовов. Базовый вариант комплектации получил неостекленный грузовой кузов.

Модификация для пассажирских перевозок получила имя Caravelle. Отличительными чертами стали пластик превосходного качества, три ряда сидений с возможностью быстрого съема. И хотя салон обит пластиком, данная характеристика не портит интерьер. В холодное время года за комфорт и тепло в салоне отвечали два отопительных агрегата.

Multivan – модификация, получившая в салон кресла, расположенные друг к другу. Раздвижной стол посреди интерьера прибавил машине достоинств.

Флагманской версией минивэна стала модификация Vestfalia/California, оснащенная подъемной крышей и различным оборудованием. В конце тысячелетия модель обновилась – теперь изменились капот, крылья, передняя часть машины. Заметим, что каждый раз инженерам и дизайнерам компании удавалось удачно потрудиться над совершенствованием автомобиля.

Технические характеристики

На базе рассматриваемого транспортного средства имели место различные модификации, однако основными принято считать следующие: пассажирскую, грузовую и грузопассажирскую. С характеристиками машины стоит познакомиться ближе.

Страны производства	Германия, Австрия
Производитель	Volkswagen AG
Тип кузова	минивэн
Кол-во мест	3; 9
Кол-во дверей	4
Привод	передний
КПП	5 ступеней, механика
Объем бака, л	80
Масса, кг	2580
Снаряженная масса, кг	1580
Тип тормозов	дисковые
Мощность двигателя, л. с.	68

Двигатель — 68-сильный дизельный мотор. Ходовая часть авто представлена передней подвеской независимого типа. Торсионная подвеска оснащена стабилизатором поперечной устойчивости, тогда как задняя – пружинная независимого типа. ABS служит приятным бонусом в фургоне с передними и задними дисковыми тормозами.

В зависимости от типа двигателя, максимальная скорость рассматриваемой модели колеблется в пределах 132 – 155 км/час. Такого диапазона более чем достаточно для решения профессиональных задач, использования автомобиля по назначению в пределах города и за его границами.

Подведем итог

Модель транспортера немецкого и австрийского производства получила множество технических изменений, благодаря чему завоевала признание среди представителей водительского сообщества по всему миру. Несмотря на последующее появление моделей Т5 и Т6, четвертая генерация по-прежнему выглядит привлекательно для многих целей.

Дизельные и бензиновые двигатели Фольксваген Транспортер Т4

Бывают автомобили популярные, а бывают культовые, такие как Volkswagen Transporter T4.

Изначально, фирма не думала изготавливать микроавтобусы, ей вполне хватало маленьких симпатичных жуков. Но послевоенной Европе требовался транспорт для перевозки небольших грузов, что явилось стимулом для создания первой версии Транспортера. Вторая версия безкапотного автобуса от Volkswagen появилась в 1967 году. В конструкции используются агрегаты «Жука».

Внутри столько свободного места, что для сотен тысяч людей Т2 стал домом на колесах. У Транспортера очень дружелюбная внешность: задняя дверь расположена высоко, зато сдвижная по правому борту была особенной гордостью фирмы. В 1979 выпущен новый Volkswagen Transporter T3. Микроавтобус Volkswagen четвертого поколения производился с августа 1990 до 2003 года. Для рынка появление Т4 стало сенсацией самая популярная модель последних десятилетий германского производства 

В отличии от других микроавтобусов, спереди достаточно места. Управлять этой машиной можно с категорией «Б» в правах. С места автомобиль стартует удивительно резво, но скороходом его не назовешь. На кочках Transporter плавно колышется вверх-вниз, практически, плывет над дорогой. 

Одним из удачных двигателей Фольксваген Транспортер Т4 считается 2.5 TDI. Данный силовой агрегат обеспечивает наилучшую динамику, чем остальные дизельные моторы, менее чувствителен к качеству солярки. На не турбированных двигателях приходится чаще ремонтировать ГБЦ. В тех случаях когда все узлы двигателя подверглись сильному износу стоит рассмотреть возможность замены на бу контрактный двигатель на VW T4 или купить восстановленный двигатель после капитального ремонта из Германии с гарантией до 365 дней. Бензиновые двигатели
1.8 PD     SOHC 8v 67 л.с. / 49 kW 1990–1992
2.0 AAC  SOHC 8v 84 л.с. / 62 kW 1990–2003
2.5 AAF, ACU SOHC 10v 110 л. с. / 81 kW 1990–1997
2.5 AET, APL, AVT SOHC 10v 115 л.с. / 85 kW 1997–2003
2.8 AES VR6 DOHC 12v 140 л.с. / 103 kW 1996–2000
2.8 AMV, AXK VR6 DOHC 24v 204 л.с. / 150 kW 2000–2003

Дизельные двигатели
1.9 D 1X SOHC 8v 61 л.с. / 45 kW 1990–1995
1.9 TD ABL SOHC 8v 68 л.с. / 50 kW 1993–2003 
2.4 D AAB SOHC 10v 78л.с. / 57 kW 1990–1998
2.4 D AJA SOHC 10v 75 л.с. / 55 kW 1997–2003

2.5 TDI AJT, AYY SOHC 10v 88л.с. / 65 kW 1998–2003
2.5 TDI AHY, AXG SOHC 10v 151л.с. / 111 kW 1998–2003
2.5 TDI ACV, AUF, AYC, AXL SOHC 10v 102 л.с. / 75 kW 1995–2003

Большинство VW Т4 оснащено 5-ступенчатыми механическими коробками передач МКПП. Автоматические коробки передач АКПП встречаются реже, больше предназначены для Caravella и Multivan.

В одной только Германии было изготовлено более 2,5 млн. таких Транспортеров разных модификаций: микроавтобусы, фургоны, грузовики, грузопассажирские и пожарные машины, скорые помощи. На родине производство этой машины прекратили в 2003 году, но VW Т4 оказался долгожителем. И спрос на них не падает – легенды всегда популярны.

Volkswagen T4 — предохранители и реле

1	Блок управления кондиционером 1 – с автоматическим управлением температурой — в панели управления отопителем, передний
2	Блок управления кондиционером 2 — с автоматическим управлением температурой — в панели управления отопителем, задний — центральная стойка
3	Блок управления вентилятором испарителя (кондиционер) — с задним кондиционером — за правой задней отделочной панелью
4	Блок управления электродвигателем вентилятора кондиционера /отопителя 1 — с автоматическим управлением температурой- передний — блок вентилятора
5	Блок управления электродвигателем вентилятора кондиционера /отопителя 2- с автоматическим управлением температурой — задний- днище кузова, в центре
6	Усилитель сигнала антенны — за панелью приборов, со стороны пассажира
7	Резистор генератора- около дополнительных реле — CV/AUF, с генератором 150А/ АКПП /автоматическим управлением температурой — за центральной частью приборной панели
8	Дополнительная аккумуляторная батарея — под сиденьем водителя
9	Аккумуляторная батарея
10	Блок управления сигналом центрального замка — за приборной панелью
11	Блок управления системы поддержания скорости (с электродвигателем привода дроссельной заслонки) — функции управления системой поддержания скорости выполняет электронный блок управления двигателем
12	Электронный блок управления системой поддержания скорости (без электродвигателя привода дроссельной заслонки) — за приборной панелью, со стороны пассажира
13	Диагностический разъем (DLC) — приборная панель, со стороны водителя
14	Блок диагностики — 05/99 (кроме AAC/ABL /AET/AES /AJA) — в комбинации приборов
15	Реле электродвигателя вентилятора системы охлаждения — за левой фарой
16	Резистор 1/2 электродвигателя вентилятора системы охлаждения — за левой фарой
17	Блок управления нагревателем охлаждающей жидкости (с дополнительным нагревателем охлаждающей жидкости — D3W/ B4W/D4W) — в отопителе — днище кузова, в центре
18	Блок управления нагревателем охлаждающей жидкости (с дополнительным нагревателем охлаждающей жидкости — B7W/D7W) — за приборной панелью, со стороны пассажира
19	Зуммер предупреждения об аварийном давлении моторного масла — в блоке управления комбинацией приборов
21	Блок предохранителей /реле, приборная панель 1
22	Блок предохранителей /реле 2, приборная панель — под блоком предохранителей /реле 1 приборной панели
23	Блок предохранителей /реле, приборная панель 3 — над блоком предохранителей /реле приборной панели 1
24	Блок предохранителей /реле, приборная панель 4 — за приборной панелью, в центре
25	Блок предохранителей /реле, сиденье водителя — под сиденьем
26	Блок предохранителей /реле, моторный отсек — на аккумуляторной батарее
27	Дополнительный предохранитель (5А/7,5А/ 10А) — в задней части блока аудиосистемы
28	Дополнительный предохранитель (10А) — в задней части блока управления навигационной системой
29	Зуммер предупреждения о не выключенных фарах- в блоке управления комбинацией приборов
30	Резистор электродвигателя вентилятора отопителя- ручное управление температурой- блок вентилятора, передний
31	Звуковой сигнал 1/2 — за передним бампером
32	Блок управления иммобилайзером — за комбинацией приборов
33	Кольцевая антенна иммобилайзера — возле замка зажигания
34	Реле указателей поворота, реле аварийной сигнализации — в выключателе аварийной сигнализации
35	Блок управления комбинацией приборов /цифровой многофункциональный дисплей — в комбинации приборов
36	Датчик температуры наружного воздуха — за передним бампером
37	Блок управления подогревом сиденья водителя — в выключателе подогрева сиденья
38	Блок управления подогревом сиденья пассажира — в выключателе подогрева сиденья
39	Блок управления системы SRS — под панелью приборов, в центре
40	Блок управления электроприводом люка
41	Блок управления тематикой — в дисплее навигационной системы
42	Блок управления интерфей сом телефона — за комбинацией приборов
43	Электронный блок управления КПП — около блока управления двигателем
44	Датчик скорости автомобиля — КПП

Ремонт двигателя Фольксваген Транспортер Т4, Т5

Ремонт двигателя микроавтобусов и фургонов Фольксваген Транспортер (Volkswagen transporter t4, t5)

Ремонт двигателя Volkswagen t4 начинается с диагностики, которая проводится с использованием современного оборудования и позволяет выявить причину неполадки. В процессе работ учитывают марку и модель авто, пробег, год выпуска и другие особенности транспортного средства. После этого оценивается примерная стоимость ремонта двигателя «Фольксваген-Транспортер» и если клиента все устраивает, мы приступаем к работам.

Порядок диагностики:

• визуальный и акустический осмотр ДВС;
• осмотр и замер различных параметров и величин;
• электронная (компьютерная) диагностика.

Диагностика неисправности ДВС Фольксваген транспортер T4 T5

Первый тип диагностики подходит, чтобы грубо выявлять причину неисправностей. Второй тип диагностики позволяет более точно определить причину поломки. Следующая работа предназначена для диагностики системы, управляемой микропроцессором, и позволяет выявлять почти любую неисправность систем. Нужно отметить, что т4 фольксваген ремонт двигателя — это направление многих компаний, но наш техцентр занимается только этими автомобилями, что положительно отражается на быстроте и качестве выполнения работ.

 

Техцентр «Автомастера» — все виды ремонта двигателя «Фольксваген-Транспортер» Т5 и Т4

Наша компания специализируется на диагностике, обслуживании и ремонте коммерческих автомобилей марки «Фольксваген» с 2002 года. Высокая квалификация специалистов и огромный практический опыт позволяют нам успешно решать любые задачи, поставленные клиентами. Так, к примеру, мы выполняем ремонт «Фольксваген-Транспортер» Т4 с двигателем (дизель) объемом 1,9 и 2,4, 2,5 литра, а также любых других силовых агрегатов, которыми когда-либо комплектовались авто этой марки.

В зависимости от места локализации и типа неисправности мы осуществляем:

• Промывку топливной системы. Мы рекомендуем промывать время от времени топливную систему специальными высокотехнологичными жидкостями, которые удаляют отложения нагара, восстанавливают чистоту форсунок и снижают токсичность выхлопа
  

 

• Ремонт генератора. Поломка генератора может быть связана с износом щёток, втулок, подшипников, коллекторов и тд. Кроме того, если на вашем автомобиле отсутствует защитный кожух поддона, то вся грязь, вода, камни и прочие материи будут постоянной «атаковать» генератор, что в итоге приведёт к неисправности. Ещё одна причина неправильной работы генератора — это сильная «растяжка» приводного ремня, либо его неправильная «натяжка», либо его отсутствие (в случае если он порвался).
  

 

• Ремонт стартера. Если при поворачивании ключа в замке зажигания до упора вы не ощущаете никаких признаков жизни, значит на то есть две причины: либо ваш аккумулятор сел, либо стартер «приказал долго жить». Причиной его поломки может быть износ втулок, обрыв обмоток, заедание или смещение контактного диска и т.д. Но что бы ни вызвало неисправность, ремонт двигателя «Фольксваген-Транспортер» Т4 должен выполняться профессионалами.
  

   

• Ремонт насоса ГУР. Гидроусилитель руля устроен так, что рулевое управление при его отказе продолжает работать (хотя руль при этом становится более «тяжёлым»). Если количество жидкости в гидросистеме соответствует норме, а руль туго поворачивается, с большой долей вероятности, причина кроется в неисправности насоса ГУР.
  

 

• Ремонт ТНВД «Транспортер» Т4. Топливный насос высокого давления — это один из самых сложных узлов системы топливоподачи дизельных двигателей. И как любой технически сложный механизм время от времени он выходит из строя. Устранить неисправность в кустарных условиях почти невозможно, поэтому рекомендуется доставить транспортное средство в техцентр.

 

И это лишь малая часть работ, которые мы выполняем в рамках услуг по ремонту дизельных двигателей «Фольксваген-Транспортер». Так как полный перечень работ занял бы слишком много места на странице, мы перечислили только наиболее востребованные и распространенные услуги. Об остальных вы можете узнать, связавшись с нашими специалистами по телефону: +7 (495) 744-51-45 или +7 (495) 740-75-73.

Двигатель	т4	т5
замена ГРМ	1,9 — 5000 2,4 2,5 — 8500	1,9 — 7500 2,0 — 8500
замена приводного ремня	1000	1000
замена насоса ГУР	2500	2500-4000*
замена генератора	2000	1,9 — 2000 2,5 — 5000
замена свечей накала	1,9 — 1500 2,4 2,5 2000-3000*	1,9 — 1500 2,5 — 6000
замена водяной помпы	при замене ГРМ	1,9 при замене ГРМ; 2,5 — 6000*
замена стартёра	1500-2000*	2000
кап ремонт
диагностика компьютерная	1000	1000
замена ТНВД	5000-6000	7500-8500
ремонт ТНВД (с обкаткой на стенде)	8000	—
промывка топливной системы	5500*	5500*
замена компрессора кондиционера	3000-5000***	3000
заправка кондиционера	1500	1500-2500
замена турбины	6000-8000*	6000-8000*
замена турбины CFCA		15000
замена сдвоенного насоса		2500
замена р/вала		20000-25000

Характеристики двигателя Фольксваген Транспортер

История производства автомобилей Фольксваген Транспортер уходит в далекий 1990 год, в котором летом именитый концерн «Volkswagen» дал старт выпуску принципиально новой линии моделей Transporter. До этого под таким наименованием уже были выпущены автомобили, которые получили маркировки T1, T2 и T3. Принципиальным отличием от моделей предыдущих выпуском является тот факт, что автомобили T4 получили бескапотную компоновку, для которой было характерно переднее поперечное расположение силовых агрегатов. Иными словами, таким действием компания сделала довольно серьезный рывок в области развития легких коммерческих автомобилей. Это обусловливается предложением для покупателей целый модельный ряд более усовершенствованных автомобилей, в сравнении с прежними популярными, но в тоже время уже морально устаревших моделей линии Г3 с мотором, расположенным сзади.

Немного о технических характеристиках автомобилей

В автомобили Т4 были встроены шасси длиной 3.3м, фургоны с объемами 5,5 и 6,4 м, у которых было три варианта грузоподъемности – 1200, 1000 и 800 кг. соответственно. Переход на более низкорамные шасси дал шанс выпустить модификации, которыми ранее семейство Транспортер не могло пополниться, поскольку этот выпуск является инновацией своего рода. Также довольно серьезно вырос уровень безопасности эксплуатации – передние сиденья вынесены за переднюю ось, и по этой причине основная ударная энергия может гаситься деформируемыми зонами, которые находятся в отсеке для двигателя.

Также изменения затронули и двери, которые стали больше, также в них были встроены усилители. Эргономика и дизайн приборной панели тоже серьезно отличались от примитивных панелей в предыдущих моделей. К слову, все это великолепие поколения Т4 сохранилось и до сегодняшних современных моделей линии Транспортер.

Первые двигатели VW Transporter

Если рассматривать самые первые моторы, которые появились в автомобилях модельного ряда Transporter, то видно, насколько серьезно прогрессировал выпуск моторов в целом в компании «Volkswagen». Первые моторы имели объемы 1.2 и 1.4 литра соответственно. Мощность у них была предельно низкой – 55-65 л.с. Автомобили могли развивать максимальную скорость в 110-125 км/ч, и при такой мощности это еще неплохой показатель. Зато эти модели могли похвастать невероятно высоой степени надежности, поскольку их ресурс был весьма высок – порядка 180 000 км можно было проехать на автомобиле с такими двигателями и совершенно не заботиться о проведении ремонтных работ. Иными словами, серьезные вмешательства начинались только после прохождения такого расстояния. Это тоже логично – все-таки, скорость большую нельзя было развить, соответственно, автомобиль шел мягко, плавно и тихо, посему и мог проходить такие большие расстояния без вскрытия определенных проблем.

Первые двигатели смело можно называть безопасными и надежными хотя бы потому, что детали и узлы имели хорошую износостойкость. Единственным недостатком этих двигателей считается негерметичность систем, в первую очередь, питания и охлаждения. Постоянно подтекало масло, охлаждающая жидкость расходовалась быстрее, чем нужно, так был весьма высокий расход топлива – порядка 13 л в городских условиях. Зато выделялось еще одно преимущество использования таких двигателей – ремонтные работы, а также запчасти, которые были необходимы для двигателей, имели сравнительно низкую стоимость в сравнении с автомобилями того же класса других марок. Именно поэтому водители так любят автомобили Transporter с самыми первыми модификациями моторов.

Более мощные моторы начала XXI века

В начале нынешнего столетия ситуация с выпуском новых двигателей приобрела некий прогрессивный подход. По истечении десятилетий компания всерьез задумалась над выпуском более мощных и надежных моторов для автомобилей Volkswagen Transporter. И таким образом, на свет появились первые модели двигателей ACV. Мощность этих моторов составляла от 80 до 105 л.с., крутящий момент в диапазоне от 100 до 125 Нм. Объемы двигателей варьировались от 1.4 л до 1.8. В общем и целом, если рассматривать среднюю сравнительную характеристику новых для начала 21 века двигателей, то

можно сказать, что они получились весьма добротными и некапризными. Расход топлива существенно снизился, появились новшества в системах охлождения и питания, которые привлекли внимание покупателей. Однако все это повлияло на срок долговечности двигателей – если раньше на моторах Транспортера можно было спокойно откатать 180 000 км, то на двигателях ACV можно было проездить без серьезных вмешательств порядка 150-160 тыс. км.

Если рассматривать отдельные моторы ACV, то среди них можно выделить два силовых агрегата – бензиновый движок с объемом 1.6 и мощностью 103 л.с. и дизельный мотор с объемом 1.8 л. и мощностью 110 л.с. Эти двигатели являются самыми мощными во всей серии моторов, также они имеют прекрасные показатели по расходу топлива – первый по городу расходует 10,5 л., второй – 9,3 л. Также нельзя не сказать о том, что эти силовые агрегаты являются самыми износостойкими и надежными в целом, в сравнении с остальными двигателями, появившимися на свет. Оба типа двигателей преимущественно использовались и используются до сегодняшнего времени на автомобилях Фольксваген Транспортер Т4.

Современные двигатели

Нынешнее время характеризуется для концерна Volkswagen появлением огромного количества двигателей с самыми высочайшими техническими особенностями. Они даже не идут в сравнение с предыдущими собратьями – настолько серьезного прогресса добилась служба разработки и производства силовых агрегатов в компании «Volkswagen». В первую очередь хочется отметить прогресс двигателей ACV, которые сегодня успешно используются на автомобилях Т4 и Т5, а также на Multivan. Первоначально хочется обратить внимание на то, насколько серьезно производители поработали над герметичностью всех систем. В этом вопросе у компании получилась своеобразная волна – самые первые двигатели компании не уступали в этом компоненте никому и были лучшими, затем в начале последнего столетия эта характеристика была у двигателей Volkswagen едва ли не самой отстающей. Сейчас же разработчики и производители снова вернули статус самых герметичных агрегатов своим изделиям.

Нельзя не отметить и то, что в двигателях  ACV для Транспортер Т4 появился универсализм. Проявляется это качество, прежде всего, в том, что запчасти, которые необходимы для нормальной работы двигателя, сейчас можно покупать не только фирменные, но и от других автомобилей. Возможно, это не самым лучшим образом пошло на пользу компании, поскольку спрос на родные запчасти сначала слегка снизился. Однако постепенно запчасти у Фольксвагена тоже стали универсальными, и производители убили двух зайцев сразу – сделали покупаемыми не только свои двигатели, но и запчасти для них тоже.

Отдельные модели новейших двигателей для Volkswagen Transporter

Невозможно пытаться сосчитать, какое количество двигателей в новейшей истории концерна было выпущено для автомобилей модельного ряда Транспортер – все равно в итоге собьешься! Настолько большой выбор двигателей для автомобилей данного типа обязывает покупателей немного призадуматься над конечным своим выбором – все-таки все моторы являются достаточно разными, несмотря на то, что были произведены они одним и тем же концерном. Каждый из моторов, являясь дизельным или бензиновым, имеет свою частичку уникальности и оригинальности, и это тоже огромная заслуга производителей – сделать свои изделия не только надежными, безопасными и относительно недорогими, но еще и в меру удивительными и в чем-то даже таинственными. Рассмотрим некоторые модели двигателей, которые сейчас ставятся на автомобили Transporter.

Transporter 2.5 TDI

Впервые этот двигатель сошел с конвейера в 2007 году. Казалось бы, прошло уже 9 лет, все-таки, немало времени для того, чтобы двигатель успел утратить лидирующие позиции в списках самых продаваемых моторов. Ан нет, эти слова не про данный силовой агрегат! Если рассматривать технические характеристики, то можно подумать, что мотор является довольно-таки средним и вовсе не примечательным для нынешних покупателей, которые ищут только самое лучшее. Мощность мотора составляет всего 110 л.с, объем 2.5 литра – да, это хорошо, это много. Но самым главным преимуществом этого двигателя является совершенно иной показатель – его ресурс. Используя в автомобиле VW Transporter T4 данный двигатель, автомобиль способен проездить более 200 000 км, при этом не требуя серьезных вложений в двигатель и вмешательств. Сегодня сложно найти мотор с таким ресурсом, особенно для грузового автомобиля. Именно поэтому данный двигатель ценится огромным количеством водителей не только по всей Европе, но и во всем мире! Об этом говорит и продаваемость данного мотора, которая не собирается сдавать позиции до сих пор!

Двигатель 2.5 TDI

Еще ценен двигатель высокой герметичностью систем, своей относительно невысокой стоимостью и небольшой стоимостью обслуживания и проведения ремонтных работ. Запчасти на этот двигатель можно найти почти в любом магазине, поскольку двигатель весьма универсален. В двигателе есть только один серьезный недостаток – иногда выходят из строя цилиндры, что создает дополнительную вибрацию в автомобиле и шум. Но все же, несмотря на это, мотор остается одним из самых ценных двигателей во всем огромном ряду модификаций для автомобилей Транспортер!

 Дизельный двигатель ACV 2.0

Если говорить честно, то дизельные двигатели у Фольксвагена – не самая сильная сторона компании. Нечасто бывает такое, что покупатели ахают и бегут покупать новый дизельный мотор, сошедший с конвейера и представленный в широких массах. Однако именно такой реакцией сопровождался выпуск дизельного ACV 2.0, который и по сей день считается одним из самых удачных дизелей в Европе. Этот мотор славится своей неприхотливостью – топливный расход по городу составляет всего 7,7л/100 км, а за городом 8.2 л. Очень интересный мотор, котрый, в отличие от многих двигателей, используемых в автомобилях Фольксваген серии Транспортер не начинен большим количеством разнообразных «наворотов». Двигатель исполнен из самых экологичных материалов, которые имеют высокую степень прочности и износостойкости. Также этот двигатель полюбился водителям в первую очередь из-за того, что не стоит тратить большие деньги на ремонт и обслуживание силового агрегата. Двигатель довольно прост в своем строении, и разобраться в нем сможет каждый водитель, даже те, кто не имеет опыта.  Иными словами, мечта для любой категории водителей!

Совокупность двигателей в целом

Сравнивая все три поколения двигателей для Фольксваген транспортер, сложно выделить лучшую модель. Даже в поколениях есть некоторые особенности, которые в чем-то превосходили соседнее. Самое первое поколение двигателей отличалось небывалой надежностью и прекрасным ресурсом, и по данным показателям они уверенно лидируют среди других поколений. Среднее поколение характеризуется прогрессивностью и износоустойчивостью, а также прекрасной динамикой. В последнем поколении сложно что-то выделить, поскольку разработчики делали упорную ставку на улучшение всех характеристик и особенностей силовых агрегатов. Водителями все-таки больше всего были признаны двигатели ACV, которые, по мнению многих европейских автовладельцев, имели более лучшие показатели среди всех остальных. Между прочим, специалисты также отмечают, что двигатели ACV в сравнении со всеми остальными являются более предпочтительными для использования в автомобилях Volkswagen Transporter.

В общем и целом можно сказать, что двигатели, которые немецкий концерн производил специально для автомобилей модельного ряда Transporter, являются одними из лучших изделий в обширной истории создания силовых агрегатов немецкой фирмой. И пока пальма первенства во всех компонентах принадлежит именно им!

Range Rover. Страна производитель. История создания легенды — Ремонт мото, авто и заказ запчастей

Defender, Discovery и Freelande. В течение кратчайшего периода это детище британских конструкторов стало конкурентоспособным с такими признанными брендами, как Land Cruiser и Pajero.

Главным образом российские потребители ценят в них отличную проходимость, которая прекрасно сочетается с максимальной степенью комфорта. Про качества этого бренда говорить можно бесконечно. Страна производитель автомобилей ленд ровер, то где производят range rover Британия, славится строжайшим контролем где производят range rover. При этом основная масса продукции собирается именно в Соединенном Королевстве, что практически исключает вероятность брака.

Автомобилю сопутствовал мгновенный успех, в результате чего к середине пятидесятых годов прошлого века марка Land Rover уже стала четко ассоциироваться с понятием стойкости, долговечности и феноменальных внедорожных качеств. Военные и работники сельского хозяйства, а также работники спасательных и восстановительных служб нашли в Land Rover как раз те качества, которые им и требовались в автомобиле.

К г. Солихалл Solihull, West Midlands сходил уже й Land Rover, а фундамент для будущего доминирования на рынке был полностью заложен. Модель по-прежнему считается лучшим где производят range rover внедорожником.

В е годы существенно вырос спрос на полноприводные автомобили, а компания Land Rover оказалась в авангарде нового развивающегося сегмента рынка. В попытке найти лучшее решение возникшей задачи инженеры Rover сели за разработку транспортного средства, которое бы сочетало комфорт и ходовые качества семейного автомобиля с внедорожными возможностями Land Rover. Результатом их работы стал Range Rover, запущенный в где производят range rover в г.

Знаменитый дизайн этой модели достиг уникального уровня признания, будучи выставлен в Луврско й где производят range rover Парижа. Однако достоинства автомобиля существенно выходили за рамки комфорта и привлекательного внешнего вида, сохраняя при этом уникальные качества езды по бездорожью.

В течение х и х годов эволюция Land Rover и Range Rover продолжалась, а признание автомобилей Land Rover росло благодаря таким событиям, как ралли Париж-Дакар, продемонстрировавшее выдающуюся стойкость марки. В модельный ряд Land Rover входят еще две модели. Discovery был впервые показан на автосалоне во Франкфурте в г.

В г. В настоящее время престиж отделения по-прежнему очень высок. В его обновили последний. Он предлагается с тремя видами двигателя — V-образные 8-цилиндровые рабочим объемом 4,0 или 4,6 литра мощностью или л. Для покупателей среднего класса выпускается компактный Land Rover — Freelander. Эта модель имеет независимую подвеску всех колес и поперечное расположение двигателя. Она имеет 4-цилиндровый бензиновый и дизельный двигатели рабочим объемом 1,0 литра.

Продолжают выпускаться без изменений Discoveri и Defender. В Великобритании Defender продается в трех вариантах базы — 90, и На них ставятся турбонаддувный дизель и бензиновый V-образный 8-цилиндровый двигатель рабочим объемом соответственно 2,5 и 4,0 литра. Эти автомобили очень популярны у фермеров, их используют как полицейские и где производят range rover машины. С момента выпуска первого Range Rover в году, этот автомобиль непрерывно совершенствовался.

Параллельно с выпуском утилитарных где производят range rover компания разрабатывала автомобиль, который смог бы сочетать комфортабельность седана и проходимость внедорожника.

Год спустя после запуска в производство первого Land Rover где производят range rover модель Station Wagon с закрытым семиместным кузовом. Список ее оснащения включал обогреватель салона, стеклоочиститель с двумя щетками, мягкую обивку дверей, кожаные сиденья, защитный колпак запасного колеса. Кузов с деревянным каркасом и алюминиевой обшивкой разрабатывался ателье Tickford. Однако автомобиль оказался слишком дорогим и не имел успеха, на который рассчитывали его создатели.

Зато следующая модель стала настоящей легендой.

Где производят range rover Rover появился в году и был рассчитан в основном на американский рынок. Он оснащался бензиновым двигателем Buick V8 с системой постоянного полного привода и длинноходной пружинной подвеской. Автомобиль стал экспонатом Лувра как выдающееся достижение в области автомобильного дизайна. На многие годы вперед эта модель стала лидером в своем классе, установив новые стандарты качества.

Программа запуска машины на североамериканском рынке получила название Project Eagle.

В году создается компания Range Rover of North America. Автомобиль был рассчитан на зажиточных покупателей, поэтому в стандартной комплектации оснащался круиз-контролем, кондиционером и автоматической коробкой передач.

Land Rover Range Rover В х компания реализовывала и другой масштабный проект, в результате которого появился знаменитый Discovery, предназначенный для семейного использования. Автомобиль основывался на базе Range Rover, однако получил более простой и дешевый кузов. Его дебют состоялся во время Франкфуртского автосалона в году. Баварский автопроизводитель сразу же взялся за проектирование новой модели Range Rover, которая должна была где производят range rover корне отличаться от предшественников.

Автомобиль получил специально для него созданное шасси и перенастроенный мотор V8. Кроме того, где производят range rover можно было комплектовать 2,5-литровым дизельным двигателем BMW. Электроника контролировала в новинке всё — от систем безопасности до самовыравнивающейся подвески. В году в линейке компании появился самый маленький автомобиль — Freelander. Тогда ходила шутка, что Land Rover, кроме внедорожников, выпускает разнообразную сувенирную продукцию: В течение пяти лет, до года, Freelander оставался самым популярным полноприводным автомобилем Европы.

Любовь публики он заслужил не только удачными размерами и вездеходными характеристиками, присущими марке, но и большим где производят range rover уникальных запатентованных технологий.

Так, он первым получил систему контролируемого движения под уклон HDC, которая позволяла безопасно спускаться по наклонной плоскости.

Он стал первой моделью марки с где производят range rover подвеской всех колес, несущим кузовом и двигателем с поперечным расположением. В году Freelander обновили, где производят range rover бамперы и интерьер, а также предложив новую оптику. Land Rover Freelander В году представлен обновленный Discovery Series II с улучшенной ходовой, новым пятицилиндровым дизелем и новаторской системой непосредственного впрыска насос-форсунок.

В м выходит флагманский New Range Rover с несущим кузовом, независимой подвеской и новым силовым агрегатом. Он сразу же становится одним из лидеров среди внедорожников класса люкс. Весной года представлена модель Discovery 3, созданная с чистого листа. Она оснащалась независимой подвеской, а также электронным помощником Terrain Responce, меняющим настройки в зависимости от типа дорожного покрытия. Рама, интегрированная в кузов, снижала центр где производят range rover. В году на рынке появляется новый флагман — Range Rover Sport, который многими называется лучшим автомобилем в истории Land Rover по управляемости и динамическим показателям.

Его полюбили за компактность, маневренность и прекрасные вездеходные качества.

Покупатели полюбили британские модели за надежность, управляемость и высокое качество, отдавая должное их внедорожным характеристикам и комфортабельной езде. В году марку вместе с Jaguar покупает индийская компания Tata Motors.

Ленд Ровер страна производитель

В году дебютировал компактный кроссовер Range Rover Evoque. Он предлагается в трех- и пятидверной версиях, с приводом на два или четыре колеса. Range Rover Evoque разрабатывался для городской езды. Одной из основных задач при его проектировании было сокращение выбросов СО2 и высокая топливная экономичность.

В первый год производства было продано 88 единиц модели. Машину тепло приняли автомобильные эксперты и журналисты. Сейчас где производят range rover Land Rover продолжает развивать где производят range rover автомобилей и совершенствовать свои модели. Не последнее место в научно-исследовательских разработках отведено снижению выбросов и гибридным технологиям, которые продолжают технологическую эволюцию одной из самых авторитетных автомобильных марок в мире.

Серийный автомобиль, представленный на Женевском автосалоне года, получил название Range Rover. Под капотом стоял бензиновый двигатель V8 объемом 3,5 литра и мощностью л. Все последующие годы Range Rover постоянно модернизировался.

Range Rover. Страна производитель. История создания легенды

В году начали выпускать пятидверную модификацию внедорожника, а со временем появились версии с более качественной и дорогой отделкой салона. В году двигатель был модернизирован и получил систему впрыска топлива, а его отдача выросла до сил. Якобы руководство компании проводит поиск партнеров с китайской стороны в целях дальнейшего создания совместных автомобилестроительных предприятий.

Данное направление выбрано не случайно. Это позволит снизить расходы на где производят range rover автомобилей на австралийский и азиатский рынок, следовательно, сделает внедорожники более доступными.

Устойчивость к серину у Bacillus subtilis: идентификация серинового транспортера YbeC и метаболической сети, которая связывает метаболизм серина и треонина

Резюме

Грамположительная бактерия Bacillus subtilis использует серин не только как строительный блок для белков, но и как важный предшественник многих анаболических реакций. Более того, недостаток серина приводит к инициированию образования биопленок. Однако избыток серина подавляет рост B.subtilis . Чтобы раскрыть лежащие в основе механизмы, мы выделили мутанты-супрессоры, которые могут переносить токсические концентрации серина, с помощью трех целевых и нецелевых скринингов по всему геному. Все скрининги, а также генетическая комплементация в Escherichia coli идентифицировали пока не охарактеризованную пермеазу YbeC в качестве основного переносчика серина B. subtilis . Помимо YbeC, переносчики треонина BcaP и YbxG вносят незначительный вклад в захват серина. Штамм, лишенный этих трех переносчиков, был способен переносить 100 мМ серина, тогда как штамм дикого типа уже ингибировался 1 мМ аминокислоты.Скрининг мутантов, устойчивых к серину, также выявил мутации, которые приводят к повышенной деградации серина и повышенной экспрессии ферментов биосинтеза треонина, что позволяет предположить, что токсичность серина является результатом вмешательства в биосинтез треонина.

Заявление об оригинальности и значимости Серин является важным предшественником многих биосинтетических реакций, и недостаток этой аминокислоты может вызвать образование биопленок у Bacillus subtilis . Однако серин токсичен для роста B.subtilis . Чтобы понять причину (ы) этой токсичности и идентифицировать до сих пор неизвестные переносчики серина этой бактерии, мы провели исчерпывающий скрининг мутантов для выделения мутантов, устойчивых к серину. Этот скрининг идентифицировал YbeC, основной переносчик серина B. subtilis . Более того, мы наблюдали тесную связь между метаболизмом серина и треонина, которая отвечает за токсичность серина за счет ингибирования биосинтеза треонина.

Введение

В качестве строительного блока белков аминокислоты играют центральную роль в физиологии любой живой клетки.Помимо их роли в качестве субстратов в биосинтезе белков, они могут использоваться как источники углерода и азота. Более того, некоторые аминокислоты также необходимы для биосинтеза клеточной стенки бактерий и в качестве осмопротекторов. Соответственно, получение аминокислот — важная задача всех клеток. Это может быть достигнуто путем прямого поглощения аминокислот, присутствующих в среде для выращивания, поглощения и внутриклеточной деградации пептидов и биосинтеза de novo . Многие бактерии, такие как модельные организмы Escherichia coli и Bacillus subtilis , способны синтезировать все аминокислоты, тогда как другие, такие как минимальные бактерии рода Mycoplasma , полностью зависят от поглощения аминокислот.

Хотя аминокислоты необходимы для клеток, повышенные концентрации некоторых аминокислот, таких как глутамат, треонин или серин, могут быть вредными (Lamb and Bott 1979a; Lamb and Bott 1979b; Lachowicz et al ., 1996; Ogawa et al. др. ., 1998; Mundhada et al. ., 2017; Белицкий, 2015; Commichau et al. ., 2008; Белицкий, Соненшейн, 1998). Следовательно, гомеостаз аминокислот должен строго контролироваться, чтобы регулировать внутриклеточные уровни каждой аминокислоты в соответствии с фактическими потребностями клетки. Это требует сбалансированной активности систем для получения и разложения аминокислот. Для грамположительной модельной бактерии B. subtilis метаболизм аминокислот является одной из немногих функций основного метаболизма, которые еще полностью не выяснены. Это касается как путей биосинтеза, так и транспорта аминокислот.

Геном B. subtilis кодирует 47 известных и предсказанных переносчиков аминокислот (Zhu and Stülke, 2018). Для 19 из этих транспортеров были идентифицированы субстраты, а для четырех дополнительных транспортеров предполагаемые субстраты могут быть назначены на основе мутантных свойств (для YbxG; Commichau et al ., 2015) и отнесения к определенным регулонам (AlsT, YvbW и YvsH; Randazzo et al ., 2017; Wels et al ., 2008; Родионов et al ., 2003). Пока еще невозможно определить функциональное назначение одиннадцати потенциальных перевозчиков. Важно отметить, что некоторые белки, которые являются членами типичных семейств переносчиков аминокислот, действительно транспортируют другие субстраты, такие как недавно описанный переносчик калия KimA (Gundlach et al . , 2017).Полный обзор известных и потенциальных переносчиков аминокислот B. subtilis можно найти в таблице S1 (см. Также http://subtiwiki.uni-goettingen.de/v3/category/view/SW%201.2, Zhu and Штюльке, 2018). Важно отметить, что до сих пор не были идентифицированы или предложены переносчики для аланина, глицина, серина, аспарагина и ароматических аминокислот фенилаланина и тирозина. Идентификации новых переносчиков аминокислот препятствуют две особенности: для одной аминокислоты часто существует несколько переносчиков, как было показано для аргинина, пролина или аминокислот с разветвленной цепью (Calogero et al ., 1994; Гардан и др. ., 1995; Сековска и др. , 2001; Запрасис и др. ., 2014; Белицкий, 2015). С другой стороны, многие пермеазы обладают относительно слабой субстратной специфичностью, т.е. е. они способны транспортировать несколько аминокислот, как показано для BcaP или GltT (Belitsky 2015; Zaprasis et al ., 2015).

Нас интересует идентификация функций, необходимых для поддержания жизни минимальной клетки и соответствующего набора генов и белков. При анализе генома B. subtilis было предложено хранить переносчики аминокислот в минимальном геноме, а не в биосинтетических генах, поскольку для этого потребуется меньше генов (Reuss et al ., 2016). Однако, как указано выше, для некоторых аминокислот не было идентифицировано транспортеров. Соответственно, для этих аминокислот были включены пути биосинтеза. Ожидается, что минимальный организм, способный транспортировать аминокислоты, но не продуцировать их, будет жизнеспособен на сложных средах, но не сможет расти на минимальной среде в отсутствие добавленных аминокислот.Поскольку минимальные бактериальные штаммы имеют огромный потенциал для биотехнологических применений (Suárez et al ., 2019), способность продуцировать аминокислоты может иметь важное значение для роста на дешевых субстратах с минимальным содержанием солей.

Серин — важная аминокислота, потому что эта молекула является не только строительным блоком для синтеза белка, но также предшественником нуклеотидов, фосфолипидов, окислительно-восстановительных молекул и других аминокислот. Кроме того, снижение уровня внутриклеточного серина может быть сигналом к ​​инициированию образования биопленок у B.subtilis (Subramanian et al ., 2013), подтверждая, что регуляция гомеостаза серина очень важна. Однако метаболизм серина у B. subtilis еще полностью не изучен. Для этой аминокислоты переносчик не был идентифицирован, а знания о путях биосинтеза до недавнего времени оставались ограниченными. Действительно, путь биосинтеза серина был завершен совсем недавно в рамках исследования делеции в масштабе генома путем идентификации фосфосеринфосфатазы SerB, которая катализирует последнюю стадию этого пути (Koo et al ., 2017) (см. Рис.1 для обзора метаболизма серина у B. subtilis ). Более того, причины токсичности серина остаются загадочными. В E. coli было высказано предположение, что серин связывает и инактивирует бифункциональный фермент аспартаткиназа / гомосериндегидрогеназа (ThrA) (Mundhada et al. ., 2017), таким образом препятствуя биосинтезу треонина.

Рис. 1. Пути метаболизма серина и треонина у B. subtilis .

Модель показывает соответствующие переносчики, биосинтез треонина и его роль в качестве предшественника для биосинтеза изолейцина, а также пути биосинтеза и деградации серина.

В этой работе мы использовали фенотип сериновой токсичности B. subtilis для разработки обратного и прямого генетического скрининга для идентификации переносчиков серина. Наш анализ идентифицировал YbeC в качестве основного переносчика серина и прояснил роль переносчиков треонина в захвате серина. Используя супрессорный скрининг, мы также выделили метаболические мутанты, которые позволяют избежать токсичности серина. Эти мутанты демонстрируют либо более эффективную деградацию серина, либо сверхэкспрессию генов путей биосинтеза треонина и изолейцина, что позволяет предположить, что один или несколько ферментов этого пути ингибируются серином.

Результаты

Обзор генетических подходов, использованных в этой работе

Все наши отборы и отборы основывались на том факте, что добавление серина к минимальной среде токсично для B. subtilis 168, тогда как добавление серина к Комплексная среда LB не препятствовала росту бактерий. Более того, добавление определенных аминокислот, таких как треонин, к минимальной среде также преодолевает токсичность серина (Vandeyar and Zahler, 1986; Lachowicz et al ., 1996). Эти наблюдения предполагают, что внутриклеточный серин нарушает метаболизм аминокислот. Следовательно, можно ожидать, что штаммы станут устойчивыми к токсичности серина либо за счет устранения основного переносчика серина, либо за счет изменения аминокислотного метаболизма генов, связанных с токсичностью серина. Для идентификации этих генов мы использовали следующие подходы:

1. Целевой скрининг транспортеров

Для этой цели мы выбрали двенадцать переносчиков-кандидатов, которые отвечали двум критериям. Во-первых, эти транспортеры плохо изучены в B.subtilis , а во-вторых, они выражаются во время вегетативного роста. Этими переносчиками являются AapA, AlsT, MtrA, SteT, YbeC, YbgF, YdgF, YecA, YodF и YtnA. Мутанты для соответствующих генов (см. Таблицу S2) были сконструированы и проанализированы на способность расти в присутствии 244 мкМ L-серина. В то время как все штаммы были способны расти на минимальной среде в отсутствие серина, только мутантный штамм ybeC GP1886 был способен расти в присутствии серина, что позволяет предположить, что YbeC может действовать как переносчик серина.

2. Скрининг супрессоров, направленный на идентификацию мутантов, измененных в метаболизме родственных аминокислот

Мы выбрали для снижения токсичности серина штамм дикого типа и мутант Δ serA , который является ауксотрофным по штамму серина и зависит от поглощения. серина для роста. Из восьми изученных штаммов-супрессоров четыре были мутантами-переносчиками ( ybeC ), а остальные штаммы имели генетические повреждения, связанные с метаболизмом аминокислот. Интересно, что мутация ybeC также была обнаружена в мутанте serA в качестве супрессора, что указывает на то, что серин может транспортироваться в мутанте ybeC .

3. Скрининг всей библиотеки делеций

B. subtilis на предмет потери сериновой токсичности

Чтобы убедиться, что скрины, описанные выше, были исчерпывающими, мы также использовали библиотеку делеций, которая охватывает все несущественные гены B. subtilis (Koo et al ., 2017). В этой библиотеке каждая рамка считывания заменена кассетой с антибиотиком с относительно сильным, обращенным наружу промотором, поэтому устойчивость к токсичности серина может быть результатом делеции гена или сверхэкспрессии нижележащих генов.Чтобы различить эти возможности, мы удалили кассету с антибиотиком и повторно проверили фенотип. Если фенотип сохранялся после удаления кассеты с антибиотиком, то фенотип был вызван делецией гена; если нет, то, вероятно, из-за сверхэкспрессии нижестоящих генов. Этот скрининг идентифицировал как транспортер, YbeC, так и метаболизм аминокислот, связанный с генетическими повреждениями (таблица 1).

Таблица 1. Мутанты, устойчивые к

серину, идентифицированные с помощью полногеномного скрининга

Идентификация пермеазы, которая придает чувствительность к L-серину

И наш целевой скрининг 13 экспрессированных, не охарактеризованных транспортеров, и наш скрининг B. Библиотека делеций subtilis идентифицировала только один предполагаемый переносчик, YbeC, потеря которого придает устойчивость к серину. Подтверждая важность YbeC, 50% мутантов из супрессорного скрининга (Выбор # 2) имели мутации, нацеленные на ybeC . Кроме того, мутант glpQ (BKE02130), штамм из полногеномного скрининга (Выбор № 3), который подавлял токсичность серина из-за сверхэкспрессии, вероятно, генерирует обильную антисмысловую РНК ybeC (Таблица 1).Чистый эффект антисмысловой экспрессии заключается в снижении экспрессии ybeC , что объясняет его фенотип устойчивости к серину.

Чтобы проверить, устойчив ли мутант ybeC к более высоким концентрациям серина, мы культивировали мутант GP1886 при увеличивающихся концентрациях серина (до 100 мМ) и регистрировали рост бактерий. В то время как штамм дикого типа не мог расти при концентрациях, превышающих 244 мкМ, мутант ybeC был способен переносить до 11 мМ серина (см. Таблицу 2).Помимо серина, антиметаболит серина гидроксамат также подавляет рост B. subtilis . Чтобы проверить, способствует ли потеря YbeC росту в присутствии этого аналога серина, мы культивировали штамм дикого типа 168 и мутант ybeC GP1886 в присутствии DL-серина гидроксамата (1 мг / мл). Как показано на фиг. 2A, дикий тип был чувствителен к этой молекуле, тогда как мутант ybeC был несколько более устойчивым. Таким образом, потеря YbeC придает устойчивость как к серину, так и к его токсичному аналогу серингидроксамату, что позволяет предположить, что этот белок является переносчиком серина.

Таблица 2:

Устойчивость отобранных мутантов B. subtilis к серину.

Рис. 2. YbeC является переносчиком серина.

A. Чувствительность штамма 168 дикого типа и мутанта с делецией ybeC к серину и токсичному аналогу серина DL-серингидроксамату. Клетки дикого типа 168 и мутант с делецией ybeC выращивали в минимальной среде C-Glc до OD ₆₀₀ 1,0 и получали серийные разведения (10-кратные). Эти образцы помещали на планшеты с минимальным содержанием C-Glc, не содержащие серина, 1 мМ серина или 8 мМ DL-серина гидроксамата.Планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 48 ч. B. Анализ комплементации транспорта серина в E. coli . Рост мутанта E. coli sstT JW3060, несущего пустой вектор (pWH844), сравнивали с ростом JW3060 с плазмидой, кодирующей полноразмерный YbeC (pGP2987) или YbeC без С-конца (pGP2988) на M9. минимальные пластинки в присутствии и отсутствии серина. Планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 48 ч.

Выделение и начальная характеристика мутантов, способных расти в присутствии серина

Целевой анализ потенциальных переносчиков аминокислот идентифицировал YbeC как единственного кандидата в переносчика серина.В попытке идентифицировать больше генов, участвующих в токсичности серина, мы культивировали штамм 168 B. subtilis дикого типа в присутствии различных концентраций серина. Кроме того, мы использовали ауксотрофный по серину мутант serA , который зависит от поглощения серина для роста, и мутант ybeC , который уже переносит до 11 мМ серина (см. Выше). Всего мы выделили восемь мутантов, которые проявили повышенную устойчивость к серину в пяти различных селекционных экспериментах.Один мутант для каждого отбора подвергали полному секвенированию генома для выявления основных мутаций. В одном из мутантов (GP2324, выделенный из дикого типа 168 в концентрации 1 мМ серина) была обнаружена мутация ybeC . Таким образом, мы протестировали оставшиеся мутанты на наличие мутаций в ybeC . Поразительно, что четыре из восьми мутантов приобрели мутации в ybeC . Эти мутации привели к продукции усеченных и, следовательно, возможно неактивных белков YbeC или к делеции в рамке считывания 236 аминокислот (в GP3050).Идентификация множественных мутантов-супрессоров, влияющих на YbeC, убедительно подтверждает решающую роль YbeC в устойчивости к серину.

Из серин-устойчивых штаммов, фенотип которых не был вызван мутацией ybeC , два штамма, происходящие от штамма 168 дикого типа, имели дупликацию хромосомной области yokD-thyB размером примерно 16 т. п.н. Интересно, что эта область содержит ген ilvA , кодирующий треониндегидратазу, участвующую в биосинтезе изолейцина из треонина.Остальные три мутанта (происходящие от мутанта serA и мутанта ybeC с 10 и 17 мМ серином, подробности см. В Таблице S2) имели мутации, влияющие на репрессор генов биосинтеза треонина, thrR (Rosenberg et al. al ., 2016) и мутации в регуляторных областях промоторных областей sdaAB и hom соответственно (Таблица S2). Все эти гены участвуют в метаболизме серина и треонина, что свидетельствует о тесной взаимосвязи между метаболическими путями этих сходных аминокислот (дальнейший анализ см. Ниже).

YbeC является переносчиком серина

Все три целевых и объективных анализа мутантов, устойчивых к серину, определили YbeC в качестве основного игрока. YbeC подобен известным переносчикам аминокислот, классифицируется как член суперсемейства аминокислота-полиамин-органокация (см. Таблицу S1), а мутант ybeC имел фенотипы, ожидаемые для основного переносчика серина. Чтобы проверить эту идею, мы использовали мутант E. coli , у которого отсутствует главный переносчик серина SstT.Этот штамм менее чувствителен к ингибированию роста серином (Ogawa et al. ., 1997; Ogawa et al. ., 1998). Мы клонировали ген ybeC в вектор экспрессии pWH844 и использовали полученную плазмиду pGP2987 для трансформации мутанта sstT JW3060 (Baba et al ., 2006). Действительно, экспрессия переносимого плазмидой ybeC в E. coli JW3060 восстанавливала токсичность серина (рис. 2B). Взятые вместе, как генетическая характеристика, так и функциональное дополнение E.coli , лишенный переносчика серина, демонстрирует, что YbeC действительно является переносчиком серина.

Ген ybeC образует моноцистронную транскрипционную единицу (Nicolas et al ., 2012). Для изучения активности промотора ybeC и его возможной регуляции серином участок длиной 257 п.н. (222 п.н. перед стартовым кодоном трансляции ATG и 35 п.н. кодирующей области ybeC ) был слит с промотором lacZ. ген. Полученный штамм GP2965 культивировали в минимальной среде в присутствии и отсутствии серина, а также в сложной (LB) среде.При очень сходной активности β-галактозидазы (144 ± 2, 132 ± 8 и 135 ± 10 единиц на мг белка, соответственно) это слияние одинаково экспрессировалось независимо от присутствия серина в среде, что указывает на конститутивную экспрессию ybeC. .

Серин и треонин разделяют перекрывающиеся транспортеры

Транспортеры треонина способствуют захвату серина

Идентификация жизнеспособных мутантов serA ybeC в супрессорном скрининге (Скрининг № 2 выше) свидетельствует о том, что мутантные белки YbeC сохраняют некоторую транспортную активность или что YbeC — не единственный переносчик серина.Чтобы решить эту проблему, мы удалили ген ybeC в мутанте serA , который является ауксотрофным по серину. Полученный двойной мутант GP2941 зависит от поглощения серина для жизнеспособности. Анализ роста этих мутантов показал, что как мутант serA , так и двойной мутант serA ybeC не могли расти в отсутствие серина (среда с С-глюкозой). Напротив, штаммы, лишенные гена ybeC , могли расти в минимальной среде с добавлением серина (см.рис.3А). Таким образом, мутант Δ ybeC все еще способен транспортировать серин.

Рис. 3. Вклад переносчиков треонина в захват серина.

Клетки указанных штаммов выращивали в минимальной среде C-Glc до OD600 1,0 и готовили серийные разведения (10-кратные). Эти образцы помещали на чашки с минимальным содержанием C-Glc, не содержащие серина или 1 мМ серина. Планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 48 ч. A. Комбинация делеции ybeC с делецией гена serA , кодирующего фосфоглицератдегидрогеназу.Рост мутантов с одной делецией ybeC (GP1886) и serA (GP2392) сравнивали с ростом комбинированного делеционного штамма ybeC и serA (GP2941). B. Устойчивость штаммов с делецией транспортера треонина к серину. Штаммы с делецией bcaP (BKE09460) и ybxG (GP2396) сравнивают со штаммом дикого типа 168 и штаммом с делецией ybeC (GP1886). C. Комбинация делеции serA со штаммом делеции bcaP, ybeC и ybxG .Рост штамма 168 дикого типа сравнивали с GP2392 ( serA ), GP2955 ( serA bcaP ybeC ybxG ) и GP2950 ( bcaP ybeC ybxG ).

Серин и треонин химически подобны друг другу, а транспортер E. coli SstT способен транспортировать как серин, так и треонин (Kim et al ., 2002). Таким образом, мы рассмотрели возможность того, что переносчики треонина могут вносить вклад в захват серина в B. subtilis и , наоборот, .На основе анализа ингибирования роста треонином и его аналогом 4-гидрокситреонином пермеазы BcaP и YbxG были идентифицированы как предполагаемые переносчики треонина в B. subtilis (см. Таблицу S1, Белицкий 2015; Commichau et al ., 2015). ). Чтобы проверить возможную роль этих пермеаз в транспорте серина, мы использовали одиночные, двойные и тройные мутанты, лишенные ybeC, bcaP и ybxG соответственно. Полученные штаммы проверяли на их устойчивость к серину.Как показано на фиг. 3B, одиночные делеции bcaP и ybxG придают только слабую устойчивость к ингибированию роста серином, тогда как потеря ybeC приводит к значительной устойчивости (см. Также таблицу 2). Это наблюдение подтверждает, что YbeC является основным переносчиком серина в B. subtilis .

Двойные мутанты, лишенные YbeC и одного из транспортеров треонина, продемонстрировали существенное повышение устойчивости к серину, что указывает на то, что обе треониновые пермеазы вносят вклад в транспорт серина (см. Таблицу 2).Напротив, двойной мутант bcaP ybxG был намного более чувствителен к серину, чем мутант ybeC . Это наблюдение подтверждает вывод о том, что YbeC является основной сериновой пермеазой. Анализ двойных мутантов, лишенных YbeC и либо YbxG, либо BcaP, показывает, что потеря BcaP имеет более высокий вклад в устойчивость к серину по сравнению с потерей YbxG (таблица 2, сравните GP2951 и GP2949). Это указывает на то, что BcaP может быть более активным в транспорте серина, чем YbxG. Удаление трех генов, кодирующих пермеазу, в тройном мутанте GP2950 привело к беспрецедентной устойчивости к серину до 100 мМ (таблица 2).Это открытие указывает на то, что эти три белка могут быть ответственны за большую часть захвата серина у B. subtilis . Если бы эти белки были единственными сериновыми пермеазами, можно было бы ожидать, что ауксотрофный мутант serA , лишенный трех пермеаз, был бы нежизнеспособен. Однако этот мутант (GP2955) все еще мог расти на минимальной среде в присутствии серина (рис. 3С). Таким образом, B. subtilis обладает по крайней мере одной дополнительной пермеазой, которая способна транспортировать серин.

Анализ транспорта треонина

Наши результаты показывают, что два ранее предложенных транспортера треонина также активны как минорные сериновые пермеазы. Затем мы спросили, способен ли YbeC также транспортировать треонин. Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали наблюдение, что треонин токсичен для B. subtilis при добавлении в концентрациях, превышающих 50 мкг / мл (Lamb and Bott, 1979a; Lamb and Bott, 1979b). В нашей экспериментальной установке треонин (10 мМ) подавляет рост B.subtilis 168. Инактивация гена bcaP дала преимущество в росте, мутант bcaP рос в присутствии треонина, а также штамм дикого типа в отсутствие этой аминокислоты. Напротив, делеции ybxG или ybeC имели лишь незначительные эффекты (рис. 4A). Это наблюдение подтверждается анализом двойных и тройных мутантов: в то время как все мутанты, лишенные bcaP , показали устойчивый к треонину рост, этого не было для двойного мутанта ybeC ybxG GP2952, который все еще экспрессирует BcaP (рис. 4Б). Эти наблюдения предполагают, что BcaP является основным переносчиком треонина в B. subtilis .

Рис. 4. Торможение роста треонином.

A Штаммы с одиночной делецией для ybeC (GP1886), bcaP (BKE09460) и ybxG (GP2396) выращивали в среде C-glc с 10 мМ треонином по сравнению со штаммом дикого типа 168 и штаммом дикого типа. штамм 168 дикого типа в среде C-glc без треонина. B Рост мутантов с двойной делецией bcaP ybeC (GP2949), ybeC ybxG (GP2951) и bcaP ybxG (GP2952) сравнивали с ростом делеционного штамма bcaP ybeC ybxG и дикого штамма. штамм типа 168 в среде C-glc с 10 мМ треонином.

Чтобы проверить наличие дополнительных транспортеров треонина и получить дополнительные доказательства относительной роли BcaP, YbxG и YbeC в захвате треонина, мы удалили ген thrC в диком типе 168 и в соответствующих мутантах транспортера. . Ген thrC кодирует треонинсинтазу, которая катализирует заключительный этап биосинтеза треонина. Как и ожидалось, мутант thrC был ауксотрофным по треонину (данные не показаны). Делеция bcaP отдельно или в комбинации с ybeC привела к улучшению роста как при 0.04 и 4 мМ треонина по сравнению с одиночным мутантом thrC (см. Рис. 5). Комбинация мутаций thrC, ybeC и ybxG не имела эффекта по сравнению с единственной делецией thrC , что подтверждает идею о том, что YbeC и YbxG играют лишь очень незначительные роли в захвате треонина. Однако одновременная делеция bcaP и ybxG в мутанте thrC приводила к серьезному снижению роста при 0,04 мМ треонина (фиг. 5A).Дополнительная делеция ybeC оказала лишь незначительное влияние, если вообще повлияла на него. Эти данные свидетельствуют о том, что BcaP и YbxG действуют как переносчики треонина. Важно отметить, что мутант thrC , лишенный BcaP и YbxG (и YbeC), все еще способен расти в присутствии треонина, что свидетельствует о существовании по крайней мере одного дополнительного транспортера треонина (фиг. 5A и 5B).

Рис. 5. Рост ауксотрофных штаммов в сочетании с делециями переносчиков в присутствии различных количеств треонина.

Рост делеционных штаммов GP3031 ( thrC bcaP ), GP3035 ( thrC bcaP ybeC) , GP3036 ( thrC ybeC ybxG ), GP3034 ( thrC bcaP ybxG ) и thrC bcaP ybxG ) и thrC ybxG ) сравнивали с мутантом с делецией thrC (GP3030) в среде C-glc с 0,04 мМ треонином (A) и 4 мМ треонином (B).

Взятые вместе, эти результаты показывают, что BcaP является основным переносчиком треонина в B. subtilis , тогда как YbxG обладает незначительной активностью треонинпермеазы.Наши данные не подтверждают аннотацию YbeC как переносчика треонина. Более того, BcaP и YbxG обладают перекрывающейся активностью как в отношении серина, так и треонина (см. Рис. 1).

Рассмотрение токсичности серина в его метаболическом контексте

Как упоминалось выше, добавление серина к минимальной среде является токсичным, тогда как его добавление к сложной среде LB не препятствовало росту B. subtilis 168 (данные не показаны). Инактивация гена ybeC для предотвращения захвата серина или добавление нескольких отдельных аминокислот, таких как треонин, преодолевает токсичность серина (Vandeyar and Zahler, 1986; Lachowicz et al. ., 1996). Эти наблюдения предполагают, что внутриклеточный серин нарушает метаболизм аминокислот. Мутанты из супрессорного экрана (Выбор # 2) и из широкого генома (Выбор # 3) проливают свет на происхождение сериновой токсичности.

Роль сериндеаминазы в преодолении токсичности серина

Оперон sdaAB-sdaAA кодирует две субъединицы сериндезаминазы, которая катализирует разложение серина до пирувата и аммиака (Chen et al ., 2012). Как супрессорный скрининг (Выбор № 2), так и полный геномный скрининг (Выбор № 3) выявили сверхэкспрессию sdaAB-sdaAA как снижение токсичности серина. При скрининге супрессоров штамм GP2971 имел мутацию на 70 п.н. выше начала кодирующей последовательности sdaAB , что позволяет предположить, что это может влиять на экспрессию оперона. Действительно, промотор был идентифицирован в межгенной области 139 п.н. между генами yloV и sdaAB (Nicolas et al ., 2012). Чтобы проверить эту гипотезу, мы слили 166 п.н. дикого типа и мутантные области, которые содержат полную межгенную область yloV — sdaAB и, таким образом, промотор sdaAB , с геном lacZ без промотора, и сравнили экспрессию гена. ведомые этими промоутерами. Штаммы, несущие слияния lacZ , интегрированные в ген amyE , культивировали в минимальной среде и определяли их β-галактозидазную активность. Для промотора дикого типа мы обнаружили 7.4 ± 2,2 единицы β-галактозидазы на мг белка. Это соответствует очень слабой активности промотора (Schilling et al ., 2007). Экспрессия гена lacZ из мутантного промотора привела к 370 ± 48 единиц β-галактозидазы на мг белка. Таким образом, мутация привела к увеличению активности промотора в 50 раз. Более тщательный анализ последовательности мутации позволяет предположить, что последовательность TTGCCA была изменена на идеальную последовательность -35, TTGACA. Возникает соблазн предположить, что эта идеальная -35 область отвечает за более высокую экспрессию оперона sdaAB-sdaAA и, таким образом, за более высокие внутриклеточные уровни сериндезаминазы у мутанта.Этот вывод убедительно подтверждается двумя мутантами из полногеномного скрининга, пораженными yloV (BKE15840) и yloU (BKE15830), которые подавляли токсичность серина из-за сверхэкспрессии оперона sdaAB-sdaAA . Эти штаммы имеют кассеты с антибиотиками с сильным обращенным наружу промотором непосредственно перед sdaAB-sdaAA , что указывает на то, что их сверхэкспрессия подавляет токсичность серина (Таблица 1). Повышенная деградация серина сериндезаминазой, вероятно, ответственна за защитное действие, наблюдаемое при сверхэкспрессии этого фермента.

Роль метаболизма треонина в токсичности серина

На наших скринингах были идентифицированы два разных локуса, связанных с метаболизмом треонина. Во-первых, супрессорный скрининг идентифицировал дупликацию области 16 kb yokD-thyB , содержащую ilvA , как уменьшающую токсичность серина. Во-вторых, как полногеномный, так и супрессорный скрининг (Выбор № 2, 3) идентифицировали сверхэкспрессию оперона hom-thrC-thrB как снижение токсичности серина.

Треониндегидратаза IlvA использует треонин на начальной стадии биосинтеза изолейцина.Мы наблюдали дупликацию геномной области yokD-thyB приблизительно 16 kb , охватывающей ilvA в двух штаммах-супрессорах. Это наблюдение подразумевает, что IlvA может стать ограничивающим в присутствии серина или способствовать улавливанию избытка серина. Если IlvA ингибируется серином, это может быть компенсировано сверхэкспрессией гена ilvA (из-за дупликации генома) или повышенным синтезом ThrC с его подрабатывающей активностью как треониндегидратазы (Skarstedt and Greer, 1973; Rosenberg et al ., 2016) (см. Рис.1), что возобновляет синтез изолейцина. Однако это маловероятно, поскольку добавление изолейцина не снижает токсичность серина (данные не показаны). Таким образом, более вероятно, что B. subtilis IlvA также может обладать сериндегидратазной активностью, что приводит к дезаминированию серина, как было показано в Salmonella enterica и E. coli (Borchert and Downs, 2018). Чтобы проверить, является ли IlvA основной детерминантой устойчивости к серину в этих штаммах-супрессорах, мы сверхэкспрессировали ген ilvA в штамме 168 дикого типа с использованием вектора экспрессии pGP2289 (см.рис.6). Действительно, сверхэкспрессия ilvA обеспечивала устойчивость к серину. Однако уровень устойчивости сверхэкспрессирующего штамма был ниже, чем наблюдаемый для исходной супрессорной мутации с геномной дупликацией (см. Обсуждение).

Рис. 6. Устойчивость к серину мутанта с делецией thrR и штамма со сверхэкспрессией ilvA .

Рост штамма дикого типа 168 и мутантных штаммов BKE27910 ( thrR ), GP1886 ( ybeC ), GP2970 (супрессор с дупликацией ( yokD-thyB )) и дикого типа 168 с плазмидой pGP2289 ( сверхэкспрессия ilvA ) сравнивали на планшетах с минимальной средой C-Glc (10-кратное серийное разведение), содержащих 244 мкМ или 1 мМ серин. Планшеты инкубировали 48 ч при 37 ° C.

Как полногеномный, так и супрессорный скрининг выявили инактивацию репрессора ThrR и сверхэкспрессию одного из его оперонов-мишеней, hom-thrC-thrB , как снижение токсичности серина. Скрининг супрессоров (Выбор # 2) идентифицировал мутацию в thrR и мутацию перед опероном hom-thrC-thrB . Проверка мутации в вышестоящей области hom показала, что эта мутация действительно повлияла на сайт связывания ThrR (Rosenberg et al ., 2016). Более того, мутация thrR (делеция A91) привела к сдвигу рамки считывания и остановке трансляции после 35 аминокислот. Это усечение ранее наблюдалось в другом контексте. Это приводит к неактивному белку ThrR (Rosenberg et al ., 2016). Это предполагает, что мутации как thrR , так и hom в промоторной области приводят к повышенной экспрессии оперона hom-thrC-thrB . Чтобы проверить эту идею, мы протестировали активность промоторов hom дикого типа и мутантных промоторов hom-lacZ . Штаммы, несущие эти слияния, выращивали в минимальной среде и анализировали их β-галактозидазную активность. Для промотора дикого типа мы обнаружили 275 ± 35 единиц β-галактозидазы на мг белка, тогда как мутантный промотор дал 970 ± 85 единиц β-галактозидазы на мг белка. Эти значения аналогичны значениям, определенным ранее для промотора hom дикого типа и для вариантов промотора, несущих мутации в сайте связывания ThrR (Rosenberg et al ., 2016). Таким образом, эти мутации обеспечивают повышенную экспрессию оперона hom-thrC-thrB . Эти результаты подтверждаются результатами полногеномного скрининга (Выбор # 3): скрининг выявил штамм с делецией thrR , а также сверхэкспрессией оперона hom-thrC-thrB , происходящего от yutH , который находится рядом с опероном hom-thrC-thrB , что снижает токсичность серина (таблица 1).

Взятые вместе, наши результаты предполагают, что серин может вызывать дефекты биосинтеза треонина и изолейцина. Эти дефекты можно преодолеть за счет снижения поглощения серина, деградации серина или корректировки метаболизма треонина и изолейцина.

Обсуждение

Токсичность метаболитов — одна из наименее изученных областей в области микробного метаболизма. Однако токсичные метаболиты создают серьезные проблемы, если метаболические пути собираются для биотехнологических применений или при приближении к минимизации генома (Commichau et al ., 2015; Reuss et al ., 2016).Для B. subtilis только недавно были предприняты значительные усилия по выяснению механизмов устойчивости, которые позволяют бактерии справляться с токсичными промежуточными продуктами метаболизма и субстратами (Lambrecht et al. ., 2012; Commichau et al. ., 2015 ; Niehaus et al ., 2017; Niehaus et al ., 2018; Sachla and Helmann, 2019).

В этой работе мы выделили мутантов B. subtilis , которые способны расти в минимальной среде с добавлением токсичной аминокислоты серина с использованием трех различных подходов, т. е.е. (i) целевой скрининг, (ii) объективный супрессорный скрининг и (iii) полный геномный скрининг. Наши две лаборатории независимо друг от друга инициировали этот проект, преследуя разные цели: идентификацию переносчика серина и понимание происхождения токсичности серина, но информация, полученная в результате всех трех стратегий, была очень схожей и взаимодополняющей. Совмещение результатов беспристрастного и общегеномного экранов убедительно свидетельствует о том, что экраны были насыщенными, и что мы выяснили полный набор возможностей, который позволяет B.subtilis , чтобы справиться с токсичными концентрациями серина.

Все три различных скрининга идентифицировали YbeC в качестве основного переносчика серина в B. subtilis . Более того, этот транспортер хорошо работает в E. coli , в котором YbeC восстанавливает сериновую чувствительность мутанта sstT . Три особенности затрудняют идентификацию переносчиков аминокислот: во-первых, бактерии обычно содержат несколько переносчиков для одной аминокислоты, часто переносчики с высоким и низким сродством, которые обеспечивают оптимальное поглощение в широком диапазоне концентраций субстрата. В B. subtilis это относится к аргинину, аминокислотам с разветвленной цепью, глутамину, пролину и треонину. Во-вторых, переносчики аминокислот часто не очень специфичны, т.е. е. они способны транспортировать несколько субстратов, как было показано для BcaP и GltT в B. subtilis . BcaP транспортирует аминокислоты с разветвленной цепью изолейцин и валин, а также треонин (Belitsky 2015; Commichau et al ., 2015, эта работа), тогда как GltT участвует в поглощении аспартата, глутамата и токсичного продукта глифосата (Zaprasis и др. ., 2015; Wicke et al ., 2019). Наконец, переносчики аминокислот часто являются членами семейств близкородственных белков, и на основе сравнения последовательностей часто трудно предсказать субстраты. Например, переносчик аминокислот с разветвленной цепью BcaP является паралогом переносчика метилтиорибозы MtrA, а белок KimA, который является членом суперсемейства аминокислота-полиамин-органокация (APC) (см. Таблицу S1), действительно переносит калий (Gundlach и др. ., 2017). С YbeC и поглощением серина нам пришлось столкнуться со всеми этими проблемами: хотя YbeC является основным переносчиком серина, он не единственный. Наше исследование демонстрирует, что транспортеры BcaP и YbxG, которые могут транспортировать треонин, также вносят вклад в захват серина; однако их вклад довольно невелик, о чем можно судить по анализу устойчивости мутантов-переносчиков к серину. Даже в отсутствие YbeC, YbxG и BcaP B. subtilis все еще может транспортировать серин из среды, что указывает на присутствие еще дополнительных переносчиков серина.Более того, все три транспортера, участвующие в захвате серина, имеют паралоги в B. subtilis , которые могут быть ответственны за остаточный захват серина тройным мутантом ybeC ybxG bcaP , который обладает высокой устойчивостью к серину (см. Таблицу 2). Беспорядочные переносчики аминокислот важны для проектов минимизации генома (Reuss et al ., 2016, Reuss et al ., 2017). Например, одного BcaP будет достаточно для транспортировки по крайней мере четырех аминокислот. Таким образом, гены, кодирующие дополнительные транспортеры для этих аминокислот (включая ybeC ), могут быть удалены, как и соответствующие пути биосинтеза. Похоже, что природа уже реализовала это сокращение усвоения аминокислот для очень небольшого числа переносчиков: виды Mycoplasma с сильно уменьшенным геномом утратили способность продуцировать аминокислоты и, следовательно, полностью зависят от их поглощения из среды. Из-за быстрой эволюции этой группы бактерий до сих пор не удалось идентифицировать переносчики аминокислот на основе сходства последовательностей.Однако независимая жизнь искусственного сокращенного генома организма Mycoplasma mycoides JCVI-syn3.0 (Hutchison et al ., 2016) указывает на то, что эта минимальная бактерия обладает полным набором переносчиков аминокислот.

Токсичность серина может быть уменьшена не только за счет потери главного переносчика серина, YbeC. Кроме того, наши скрининги выявили и другие способы борьбы с повышенными концентрациями серина, i. е . (i) быстрое превращение серина в другие метаболиты, в основном пируват, и (ii) сверхэкспрессия генов, участвующих в синтезе треонина (оперон hom-thrC-thrB ).Комплекс сериндеаминазы SdaAA-AB превращает серин в пируват и аммиак, тем самым выводя токсины из избытка серина, а также позволяя клеткам использовать серин в качестве источника углерода и азота. Поэтому неудивительно, что удаление этой активности фермента было предпринято для увеличения выхода продукции серина в E. coli (Li et al ., 2012). С другой стороны, сообщалось, что дефицит сериндезаминазы в E. coli приводит к аномальному делению клеток даже в среде лизогенического бульона (Zhang and Newman, 2008).Интересно отметить, что штаммы, сверхэкспрессирующие оперон sda , были наиболее высокообогащенными из полногеномного пула из мутантов со вставкой транспозона B. subtilis , если библиотека была выращена в минимальной среде, дополненной токсической концентрацией серина (данные не показаны), вероятно, потому, что Поглощение серина не ограничено, но быстрое превращение в пируват и аммиак является источником углерода и азота для этих штаммов.

Существует несколько способов, которыми повышенная экспрессия оперона hom-thrC-thrB может подавлять токсичность серина.Во-первых, повышенные уровни ферментов биосинтеза треонина могут производить больше треонина. Поскольку добавление треонина к минимальной среде, содержащей серин, может частично преодолеть токсичность серина, вполне вероятно, что добавление серина лишает клетки треонина, что можно преодолеть либо за счет увеличения синтеза треонина, либо за счет внешних добавок. Во-вторых, токсичность L-серина в E. coli действует путем ингибирования активности как аспартаткиназы, так и гомосериндегидрогеназы слитого фермента ThrA (Costrejaen and Truffa-Bachi, 1977), и может действовать аналогичным образом в B.subtilis . В соответствии с этой идеей мы обнаружили, что добавление гомосерина восстанавливает рост B. subtilis дикого типа в присутствии серина (данные не показаны). Биохимический анализ с очищенной гомосериндегидрогеназой B. subtilis предоставит четкое доказательство этой гипотезы. Мы попытались очистить гомосериндегидрогеназы B. subtilis из гомосерин со сверхэкспрессией штамма E. coli , но не смогли получить активный фермент.Возникает соблазн предположить, что повышенная экспрессия ilvA при дупликации геномной области yokD-thyB является основной детерминантой фенотипа устойчивости к серину у этого супрессорного мутанта, поскольку мы наблюдали, что сверхэкспрессия ilvA фенокопировала его, хотя только частично (рис. 6). Одно из объяснений неполного эффекта сверхэкспрессии IlvA заключается в том, что фермент не только подавляет токсичность серина, но и сам токсичен для клетки, возможно, из-за накопления токсичных уровней 2-оксобутаноата или 2-аминоакрилата (Borchert and Downs, 2018).Поразительно, что ген ilvA присутствует в двух копиях в штамме-супрессоре, тогда как он присутствует на множестве копий плазмиды и экспрессируется сильным конститутивным промотором в системе искусственной сверхэкспрессии. Это может быть слишком хорошо!

Это исследование дает новое понимание важных аспектов метаболизма серина в B. subtilis и его интеграции в сеть приобретения аминокислот. Эта сеть состоит не только из биосинтетических ферментов с перекрывающимися действиями, но также из транспортеров, которые часто являются беспорядочными и транспортируют несколько аминокислот.Наша работа является отправной точкой для дальнейшего анализа сложного и взаимосвязанного набора белков, которые осуществляют транспорт аминокислот в B. subtilis .

Методы

Бактериальные штаммы и условия роста

Все штаммов B. subtilis , использованные в этой работе, происходят от лабораторного штамма 168 дикого типа. Они перечислены в Таблице S2. B. subtilis выращивали в среде LB (бульон Lysogeny), среде SP (споруляции) и минимальной среде C, содержащей глюкозу и аммоний в качестве основных источников углерода и азота, соответственно (Commichau et al . , 2008). Минимальная среда была дополнена ауксотрофными требованиями (50 мг / л) и аминокислотами, как указано. Планшеты готовили добавлением 17 г Бакто-агара / л (Difco) к жидкой среде. E. coli DH5α и JW3060 (Sambrook et al ., 1989; Baba et al ., 2006) использовали для экспериментов по клонированию и комплементации соответственно. JW3060 выращивали на минимальной среде M9 (Sambrook et al ., 1989) с глюкозой (1% мас. / Об.) В качестве источника углерода, но без казаминокислот.Серин добавляли, как указано. Для определения переносимых концентраций серина бактерии выращивали в среде с минимальной глюкозой C до OD600 1,0 и высевали на планшеты с C-Glc, содержащие широкий диапазон концентраций серина (от 1 до 100 мМ). Рост сравнивали после инкубации планшетов при 37 ° C в течение 48 часов.

Манипуляции с ДНК и секвенирование генома

Экстракцию плазмидной ДНК из E. coli проводили с использованием стандартных процедур (Sambrook et al . , 1989). Рестрикционные ферменты, ДНК-лигаза Т4 и ДНК-полимеразы использовались в соответствии с рекомендациями производителей. ДНК-полимеразу Fusion (Biozym, Германия) использовали для полимеразной цепной реакции в соответствии с рекомендациями производителя. Фрагменты ДНК очищали с помощью набора Qiaquick PCR Purification kit (Qiagen, Германия). Последовательности ДНК определяли с использованием метода терминации дидезокси-цепи (Sambrook et al ., 1989). Все вставки плазмид, полученные из продуктов ПЦР, проверяли секвенированием ДНК.Хромосомную ДНК B. subtilis выделяли, как описано (Commichau et al ., 2008). Для выявления мутаций в мутантных штаммах-супрессорах GP2324, GP2969, GP2970, GP2971 и GP2972 (см. Таблицу S2) геномную ДНК подвергали полногеномному секвенированию (Reuß et al ., 2019). Вкратце, считывания были картированы на эталонном геноме B. subtilis 168 (номер доступа в GenBank: NC_000964) (Barbe et al . , 2009). Картирование считываний выполняли с помощью программного пакета Geneious (Biomatters Ltd., Новая Зеландия) (Kearse et al. , 2012). Полиморфизм одиночных нуклеотидов считался значимым, когда общая глубина охвата превышала 25 считываний с частотой вариантов ≥90%. Все идентифицированные мутации были проверены с помощью ПЦР-амплификации и секвенирования по Сэнгеру.

Трансформация и фенотипический анализ

Стандартные процедуры использовали для трансформации E. coli (Sambrook et al. ., 1989), и трансформанты отбирали на чашках LB, содержащих ампициллин (100 мкг / мл). B. subtilis трансформировали плазмидной или хромосомной ДНК в соответствии с двухэтапным протоколом, описанным ранее (Kunst and Rapoport, 1995). Трансформанты отбирали на чашках SP, содержащих хлорамфеникол (Cm 5 мкг / мл), канамицин (Km 5 мкг / мл), спектиномицин (Spc 150 мкг / мл) или эритромицин плюс линкомицин (Em 25 мкг / мл и Lin 25 мкг / мл. ).

В B. subtilis активность амилазы была обнаружена после выращивания на чашках, содержащих питательный бульон (7,5 г / л), 17 г агара Бакто / л (Difco) и 5 ​​г гидролизованного крахмала / л (Connaught).Разложение крахмала было обнаружено сублимацией йода на чашки.

Количественные исследования экспрессии lacZ в B. subtilis проводили следующим образом: клетки выращивали в среде LB или в среде глюкозы C с добавлением серина, как указано. Клетки собирали при OD600 от 0,6 до 0,8. Специфические активности β-галактозидазы определяли с клеточными экстрактами, полученными обработкой лизоцимом, как описано ранее (Kunst and Rapoport, 1995). Одна единица β-галактозидазы определяется как количество фермента, которое производит 1 нмоль о-нитрофенола в минуту при 28 ° C.

Конструирование делеционных мутантов

Делеция генов переносчиков аминокислот и биосинтеза была достигнута трансформацией продуктами ПЦР, сконструированными с использованием соответствующих олигонуклеотидов для амплификации фрагментов ДНК, фланкирующих гены-мишени и промежуточных кассет устойчивости к антибиотикам (Guerot-Fleury et al . , 1995), как описано ранее (Wach, 1996).

Скрининг фенотипа роста всего генома

Скрининг проводили, как описано ранее (Koo et al ., 2017) с модификациями, оптимизирующими скрининг на токсичность серина. Планшеты для просеивания давали высохнуть в течение двух дней. Библиотеку BKE (Erm ^R ) помещали в 384-луночные планшеты с использованием робота для обработки жидкостей Biomek FX (Beckman Coulter) и хранили в виде глицериновой смеси. Для скрининга всей библиотеки BKE клетки закрепляли из запасов глицерина на прямоугольные чашки с агаром LB в формате 384 с использованием робота Singer Rotor, затем четыре планшета формата 384 были объединены и закреплены на чашках формата 1536. Для каждого скрининга экспоненциально растущие клетки в формате 1536 затем прикрепляли к чашкам с агаром с минимальным содержанием глюкозы (контроль роста) и к чашкам с минимальным содержанием глюкозы с добавлением трех различных концентраций L-серина (0.38, 0,75 и 1,5 мМ). Затем планшеты инкубировали при 37 ° C в увлажненном инкубаторе в течение примерно 24-44 часов. Планшеты получали с помощью камеры Powershot G10 (Canon), и серин-устойчивые мутанты идентифицировали по их положению в планшетах. Каждый мутант был подтвержден секвенированием их штрих-кодов.

Плазмиды

Плазмида pAC5 (Martin-Verstraete et al ., 1992) была использована для конструирования трансляционных слияний контрольных областей ybeC, sdaAB и hom с геном lacZ .Для этой цели области перед этими генами были амплифицированы с использованием соответствующих олигонуклеотидов. Продукты ПЦР расщепляли с помощью ПЦР Eco RI и Bam HI и клонировали в pAC5, линеаризованный теми же ферментами. Полученными плазмидами были pGP2287 ( ybeC ), pGP2295 ( sdaAB ), pGP2294 ( sdaAB *), pGP2296 ( hom *).

Для экспрессии YbeC в E. coli мы сконструировали плазмиду pGP2987. Для этого ген ybeC амплифицировали с использованием хромосомной ДНК B.subtilis в качестве шаблона. Продукт ПЦР расщепляли BamHI и SalI и клонировали в вектор экспрессии pWH844 (Schirmer et al. , 1997).

Для экспрессии треониндегидратазы IlvA в B. subtilis была сконструирована плазмида pGP2289 путем клонирования фрагмента ДНК, охватывающего ген ilvA между сайтами рестрикции BamHI и SalI вектора сверхэкспрессии pBQ200 (Martin-Verstraete et al. al ., 1994).

Благодарности

Мы благодарны Кристине Герцберг за помощь с некоторыми анализами капельного разведения, а также Фабиану М.Commichau за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана программой EU Horizons 2020 (Rafts4Biotech, 720776 для J.S.), Deutsche Forschungsgemeinschaft через приоритетную программу SPP1879 (для J.S.) и NIH (R35 GM118061 для C.A.G.).

(PDF) Цинковые потоки и гены-переносчики цинка при хронических заболеваниях

92 C. Devirgiliis et al. / Mutation Research 622 (2007) 84–93

[46] B.J. Kim, Y.H. Ким, С. Ким, Дж. У. Ким, J. Y. Кох, С. О, М.К.

Lee, K.W. Ким, М.С. Ли, Цинк как паракринный эффектор в поджелудочной железе —

гибель атических островковых клеток, Диабет 49 (2000) 367–372.

[47] Э. Хо, Н. Куан, Y.H. Цай, В. Лай, Т. Bray, Диетическое добавление цинка

ингибирует активацию NFkappaB и защищает от

химически индуцированного диабета у мышей CD1, Exp. Биол. Med. (Май-

дерево) 226 (2001) 103–111.

[48] К. Террес-Мартос, М. Наварро-Аларкон, Ф. Мартин-Лагос,

G.d.l.S.H. Лопес, В. Перес-Валеро, М.C. Lopez-Martinez, сывороточные концентрации цинка и меди

и отношения Cu / Zn у пациентов с гепатопатиями

или диабетом, J. Trace Elem. Med. Биол. 12 (1998)

44–49.

[49] Х. Хааз, В. Марет, Колебания клеточного, доступного цинка

модулируют передачу сигналов инсулина посредством ингибирования протеинтирозинфосфатаз

, J. Trace Elem. Med. Биол. 19 (2005) 37–42.

[50] Х. Хааз, В. Марет, Белковые тирозинфосфатазы как мишени комбинированного инсулиномиметического действия цинка и оксидантов

, Biometals

18 (2005) 333–338.

[51] J.P. Liuzzi, J.A. Бобо, Л.А. Лихтен, Д.А. Самуэльсон, Р.Дж.

Казинс, Ответные гены-переносчики в мышиной оси

кишечник-поджелудочная железа составляют основу гомеостаза цинка, Proc.

Нац. Акад. Sci. США 101 (2004) 14355–14360.

[52] L.G. Сондергаард, Б. Брок, М. Столтенберг, А. Фливбьерг, О.

Шмитц, К. Шмидт, Г. Даншер, Дж. Рунгби, Потоки цинка во время

острого и хронического воздействия на клетки INS-1E повышенного уровня глюкозы

уровня, Хорм.Метаб. Res. 37 (2005) 133–139.

[53] M. Seve, F. Chimienti, S. Devergnas, A. Favier, In silico identify

Определение и экспрессия генов семейства SLC30: стратегия анализа данных метки экспрессируемой последовательности

для характеристики цинка

Тканевая экспрессия транспортеров

, BMC Genomics 5 (2004) 32.

[54] Ф. Кимиенти, С. Девергнас, А. Фавье, М. Сев, Идентификация и

клонирование специфичного для бета-клеток транспортера цинка. ZnT-8, локализованный

в секреторных гранулах инсулина, Diabetes 53 (2004) 2330–2337.

[55] D. Knaack, D.M. Fiore, M. Surana, M. Leiser, M. Laurance,

D. Fusco-DeMane, O.D. Хегре, Н. Флейшер, С. Эфрат, Клональная линия клеток инсулиномы

, которая стабильно поддерживает правильный ответ на глюкозу —

активность, Диабет 43 (1994) 1413–1417.

[56] AC Powers, S. Efrat, S. Mojsov, D. Spector, JF Habener, D.

Hanahan, Процессинг проглюкагона аналогичен нормальным островкам в пан-клетках.

креатическая альфа-подобная клеточная линия, полученная от трансгенной мыши. опухоль,

Диабет 39 (1990) 406–414.

[57] Ф. Чимиенти, С. Девергнас, Ф. Патту, Ф. Шуит, Р. Гарсия-Куэнка,

Б. Вандевалле, Дж. Керр-Конте, Л. Ван Ломмель, Д. Грюнвальд, А.

Favier, M. Seve, Экспрессия и функциональные характеристики in vivo.

Перенос цинка ZnT8 в индуцированной глюкозой секреции инсулина

, J. Cell Sci. (2006).

[58] Т. Камбе, Х. Нарита, Ю. Ямагути-Иваи, Дж. Хиросе, Т. Амано,

Н. Сугиура, Р. Сасаки, К. Мори, Т. Иванага, М. Нагао, Клонирование

и характеристика нового переносчика цинка млекопитающих, переносчика цинка

5, обильно экспрессируемого в бета-клетках поджелудочной железы, J.

Биол. Chem. 277 (2002) 19049–19055.

[59] Т. Сузуки, К. Исихара, Х. Мигаки, М. Нагао, Й. Ямагути-

Иваи, Т. Камбэ, Два различных цинковых транспортных комплекса катионов

белков, способствующих диффузии, локализованных в секреторном пути

действуют для активации щелочных фосфатаз в клетках позвоночных, J.

Biol. Chem. 280 (2005) 30956–30962.

[60] R.C. Де Лиль, М. Саррас-младший, Дж. Идальго, Г.К. Andrews, Met-

аллотионеин является компонентом экзокринной секреции поджелудочной железы:

последствия для гомеостаза цинка, Am.J. Physiol. 271 (1996)

C1103 – C1110.

[61] Дж. Ван, Ю. Сонг, Л. Эльшериф, З. Сонг, Г. Чжоу, С. Прабху,

J.T. Саари, Л. Цай, Индукция сердечного металлотионеина играет важную роль в профилактике диабетической кардиомиопатии с помощью добавок цинка

, Circulation 113 (2006) 544–554.

[62] Н. Тондер, Ф.Ф. Йохансен, К.Дж. Фредериксон, Дж. Циммер, Н.Х.

Димер, Возможная роль цинка в селективной дегенерации внутригрудных нейронов den-

tate после церебральной ишемии у взрослых крыс, Neurosci.

Lett. 109 (1990) 247–252.

[63] К. Сяо, П. Чепмен, С. Нильсен, К. Экман, Ю. Харигая, С.

Юнкин, Ф. Ян, Г. Коул, Корреляционные дефициты памяти, высота Абета

и амилоид бляшки у трансгенных мышей, Science 274

(1996) 99-102.

[64] R.A. Cherny, C.S. Atwood, M.E. Xilinas, D.N. Gray, W.D. Jones,

C.A. Маклин, К.Дж. Barnham, I. Volitakis, F.W. Fraser, Y. Kim,

X. Huang, L.E. Гольдштейн, Р.Д. Мойр, Дж.T. Lim, K. Beyreuther,

H. Zheng, R.E. Танзи, К. Мастерс, А. Bush, Обработка хелатором медь-цинк

заметно и быстро ингибирует накопление бета-амилоида

у трансгенных мышей с болезнью Альцгеймера, Neuron 30

(2001) 665–676.

[65] К.В. Ричи, А.И. Bush, A. Mackinnon, S. Macfarlane, M. Mas-

twyk, L. MacGregor, L. Kiers, R. Cherny, Q.X. Ли, А. Таммер,

Д. Кэррингтон, К. Маврос, И. Волитакис, М. Ксилинас, Д.Ames, S.

Davis, K. Beyreuther, R.E. Танзи, К. Masters, Metal-protein

Аттенуация йодхлоргидроксихином (клиохинол), направленная на

Отложение амилоида Abeta и токсичность при болезни Альцгеймера: пилотное испытание 2 фазы

, Arch. Neurol. 60 (2003) 1685–1691.

[66] C.J. Frederickson, J.Y. Кох, А. Буш, Нейробиология цинка

в здоровье и болезнях, Nat. Rev. Neurosci. 6 (2005) 449–462.

[67] J.Y. Кох, С.Suh, B.J. Gwag, Y.Y. Он, C.Y. Сюй, Д.В. Choi,

Роль цинка в избирательной гибели нейронов после временной глобальной церебральной ишемии

, Science 272 (1996) 1013–1016.

[68] W. Chowanadisai, S.L. Kelleher, B. Lonnerdal, Дефицит цинка составляет

, связанный с увеличением импорта цинка в мозг и экспрессией LIV-1

и снижением экспрессии ZnT-1 у новорожденных крыс, J. Nutr. 135

(2005) 1002–1007.

[69] R.D. Palmiter, T.B. Коул, К.J. Quaife, S.D. Findley, ZnT-3, переносчик цинка в синаптические пузырьки, Proc. Natl. Акад.

Sci. USA 93 (1996) 14934–14939.

[70] T.B. Коул, А. Мартьянова, Р.Д. Пальмитер, Удаление цинка из синаптических пузырьков

не нарушает пространственное обучение, память или сенсомоторные функции у мышей, Brain Res. 891 (2001) 253–265.

[71] J.Y. Ли, Т. Коул, Р.Д. Палмитер, С.В. Suh, J.Y. Koh, Contribu-

Участие синаптического цинка в формировании разрозненных по полу бляшек у человеческих трансгенных мышей с мутантным APP

, Proc.Natl. Акад.

Sci. США 99 (2002) 7705–7710.

[72] J.Y. Ли, Дж. Ким, С. Хонг, Р.А. Черный, А. Буш, Р. Д.

Палмитер, Дж. Я. Ко, Эстроген снижает экспрессию транспортера 3 цинка и уровни цинка в синаптических пузырьках в мозге мышей, J. Biol. Chem.

279 (2004) 8602–8607.

[73] R.A. Колвин, К. Fontaine, M. Laskowski, D. Thomas, Zn2 +

транспортеров и гомеостаз Zn2 + в нейронах, Eur. J. Pharmacol.

479 (2003) 171–185.

[74] Z.H. Чи, X. Ван, Z.Y. Wang, H.L. Gao, A. Dahlstrom, L.

Huang, Транспортер цинка 7 расположен в аппарате цис-Гольджи

тус эпителиальных клеток хориоидеи мыши, Neuroreport 17 (2006)

1807–1811.

[75] MA Lovell, JL Smith, S. Xiong, WR Markesbery, Изменения

в белке-транспортере цинка-1 (ZnT-1) в мозге субъектов с

легкими когнитивными нарушениями, ранними и поздними стадиями. Болезнь Альцгеймера

легкость, Neurotox.Res. 7 (2005) 265–271.

[76] JL Smith, S. Xiong, WR Markesbery, MA Lovell, Altered

экспрессия транспортеров цинка-4 и -6 при легких когнитивных нарушениях —

, ранний и поздний мозг при болезни Альцгеймера, Neuroscience 140

(2006) 879–888.

Категория: Пежо | Classic Cars Wiki

Peugeot — крупный французский производитель автомобилей, входящий в группу PSA Peugeot Citroën. Это второй по величине автопроизводитель в Европе после Volkswagen.Корни Peugeot уходят в производство велосипедов в конце 19 века. Штаб-квартира находится в Париже, на авеню де ла Гранд Арме.

История

Ранняя история

Несмотря на то, что завод Peugeot уже некоторое время занимался производственным бизнесом, они вошли в мир колесных транспортных средств благодаря велосипедам. Арманд Пежо представил в 1882 году копейку Peugeot «Le Grand Bi» и ряд велосипедов. Велосипеды Peugeot производились до недавнего времени, хотя автомобильная и велосипедная компании разошлись в 1926 году.

Арманд Пежо очень рано заинтересовался автомобилем и после встречи с Готлибом Даймлером и другими убедился в его жизнеспособности. Первый автомобиль Peugeot (трехколесный паровой автомобиль) был произведен в 1889 году в сотрудничестве с Леоном Серполле. Паровая энергия была тяжелой и громоздкой и требовала длительной подготовки перед запуском, поэтому вскоре от нее отказались в пользу двигателя внутреннего сгорания, работающего на бензине.

В 1890 году появился первый такой автомобиль с двигателем Daimler и четырьмя колесами.

Далее последовали автомобили, двадцать девять было построено в 1892 году. Этим ранним моделям были присвоены номера типа Type 12 , например, датируемые 1895 годом. Peugeot стал первым производителем, установившим резиновые шины на автомобили с бензиновым двигателем. в том же году (цельнолитые шины; пневматические последуют в 1895 году). По внешнему виду машины все еще напоминали экипажи без лошадей и управлялись румпелем.

В 1896 году были построены первые двигатели Peugeot, которые были установлены на Type 14 ; они больше не полагались на Daimler.Последовали дальнейшие улучшения: двигатель Type 48 переместился вперед и вскоре оказался под капотом в передней части автомобиля, а не спрятан под ним; руль был принят от Тип 36 ; и они стали больше походить на современную машину.

В 1896 году Арман Пежо отделился от семейной фирмы Les Fils de Peugeot Frères и основал свою собственную компанию Société Anonyme des Automobiles Peugeot и построил новый завод в Оденкуре.

Peugeot добавила мотоцикл в свой модельный ряд в 1903 году, и с тех пор мотоциклы производятся под маркой Peugeot.

К тому году Peugeot произвела половину автомобилей, построенных во Франции. В 1916 и 1919 годах в Индианаполисе неоднократно побеждали.

Во время Первой мировой войны Peugeot в основном занялась производством оружия, став крупным производителем оружия и военной техники, от велосипедов до танков и снарядов. Послевоенное производство автомобилей возобновилось всерьез; Автомобиль стал уже не просто игрушкой для богатых, а доступным для многих. Однако в 1926 году велосипедный (педальный и моторный) бизнес разделился и сформировал Cycles Peugeot — стабильно прибыльное велосипедное подразделение, стремящееся освободиться от автомобильного бизнеса, который все больше переживает подъемы и спады.

Межвоенные годы

В 1929 году был представлен Peugeot 201 , первый автомобиль, получивший нумерацию по образцу Peugeot — трехзначный номер с нулем в центре, зарегистрированный товарный знак Peugeot. 201 также был первым серийным автомобилем с независимой передней подвеской. Вскоре после этого началась депрессия: продажи Peugeot упали, но компания выжила. В 1933 году, пытаясь возродить удачу, компания представила новую модельную линейку с аэродинамическим дизайном.В следующем году был представлен автомобиль со складывающейся убирающейся жесткой крышей — идея, повторенная Ford Skyliner в 1950-х годах и возрожденная Mercedes SLK в середине 1990-х. Совсем недавно другие производители подумали о выдвижной жесткой крыше, включая сам Peugeot с 206-кубовым двигателем.

Тремя интересными моделями тридцатых годов были 202 , 302 и 402 . У этих автомобилей были пышные кузова с фарами за наклонными решетками радиатора.Модель 402 была запущена в производство в 1935 году и производилась до конца 1941 года, несмотря на оккупацию Франции нацистами. 302-я ходила с 1936 по 1938 год. 202 были построены серийно с 1938 по 1942 год, и еще около 20 экземпляров были построены из имеющихся запасов в феврале 1945 года. Регулярное производство снова началось в середине 1946 года и продолжалось до 1949 года.

Во время Второй мировой войны заводы Peugeot были взяты на вооружение Германии, производя грузовики и фургоны. Заводы сильно бомбили.

Послевоенное

В 1948 году компания возобновила производство автомобилей с Peugeot 203 . Затем последовали другие модели, многие из которых были выполнены в элегантном стиле итальянской дизайнерской фирмой Pininfarina. Компания начала продавать автомобили в США в 1958 году. Как и многие европейские производители, расширилось сотрудничество с другими фирмами: Peugeot работала с Renault с 1966 года, а Volvo Cars с 1972 года.

Приобретение Citroën и образование PSA

В 1974 году Peugeot купила 30% акций Citroën и полностью выкупила их в 1975 году после того, как французское правительство выделило новой компании большие суммы денег.У Citroën были финансовые проблемы, потому что он разработал слишком много радикально новых моделей для своих финансовых ресурсов. Некоторые из них, особенно Citroën SM и предприятие с роторными двигателями Comotor, оказались убыточными. Другие, например Citroën CX и Citroën GS, оказались очень успешными на рынке.

Совместной материнской компанией стала группа PSA (Peugeot Société Anonyme), которая стремилась сохранить отдельные идентичности для брендов Peugeot и Citroën при совместном использовании инженерных и технических ресурсов.Таким образом, Peugeot на короткое время контролировала ценный гоночный бренд Maserati, но избавилась от него в мае 1975 года из-за краткосрочных финансовых проблем.

Как энтузиасты Citroën, так и автомобильные журналисты отмечают, что с приобретением легендарные инновации и чутье компании резко упали. Торговая марка Citroën по-прежнему была успешной с точки зрения продаж, и теперь ежегодно выпускает более миллиона единиц.

Приобретение Chrysler Europe

Затем группа приобрела европейское подразделение Chrysler (ранее называвшееся Rootes и Simca) в 1978 году, когда американский производитель автомобилей боролся за выживание. Потребовались дополнительные инвестиции, потому что PSA решила создать новый бренд для компании, основанный на спортивном автомобиле Talbot, последний раз появлявшемся в 1950-х годах. С тех пор весь модельный ряд Chrysler / Simca продавался под знаком Talbot, пока производство легковых автомобилей под брендом Talbot не было закрыто в 1986 году.

Флагманом этого недолговечного бренда был Tagora, прямой конкурент моделей PSA 604 и CX. Это был большой угловатый седан на базе механики Peugeot 505.

Все эти инвестиции вызвали серьезные финансовые проблемы для всей группы PSA: PSA потеряла деньги с 1980 по 1985 год.В результате поглощения компанией Peugeot Chrysler Europe стареющие линейки Chrysler Sunbeam, Horizon, Avenger и Alpine были переименованы в Talbots. В начале 1980-х были также новые Talbots — Solara (седан версия хэтчбека Alpine), Samba (небольшой хэтчбек на замену Sunbeam).

В 1983 году был запущен популярный и успешный Peugeot 205 , который во многом повлиял на судьбу компании.

В 1984 году PSA установила первые контакты с Китайской Народной Республикой, что привело к созданию успешного предприятия Dongfeng Peugeot-Citroën Automobile в Ухане.

В 1986 году компания отказалась от марки Talbot для легковых автомобилей, когда прекратила производство моделей Horizon / Alpine / Solara на базе Simca. То, что должно было называться Talbot Arizona, превратилось в 309 , причем бывший завод Rootes в Райтоне и завод Simca в Пуасси были переданы для сборки Peugeot. Первое было значительным, поскольку оно сигнализировало о том, что Peugeot будет построена в Великобритании впервые. Название Talbot просуществовало немного дольше на коммерческих автомобилях до 1992 года, прежде чем было полностью отложено на полку.

По опыту других европейских автопроизводителей, продажи в США пошатнулись и, наконец, стали нерентабельными, поскольку дизайн Peugeot 505 устарел. Недавно представленный Peugeot 405 оказался неконкурентоспособным с моделями из Японии, и было продано менее 1000 единиц. Общий объем продаж упал до 4261 единицы в 1990 году и до 2 240 по июль 1991 года. Это привело к тому, что компания прекратила свою деятельность в США через 33 года.

Начиная с конца 1990-х годов, когда Жан-Мартен Фольц стал президентом PSA, сочетание Peugeot-Citroën, похоже, нашло лучший баланс.Экономия средств больше не идет в ущерб стилю.

18 апреля 2006 года PSA Peugeot Citroën объявила о закрытии производственного предприятия Ryton в Ковентри, Англия. Это объявление приведет к потере 2300 рабочих мест, а также около 5000 рабочих мест в цепочке поставок.

Peugeot разрабатывает дизель-электрическую гибридную версию Peugeot 307 , которая может развивать скорость 80 миль на галлон. Это 2-дверный кабриолет, который в настоящее время находится только в стадии разработки, но он обещает стать одним из самых экономичных автомобилей в мире, если когда-либо поступит в производство.

Автомобили производства Peugeot:

границ в биосенсорике I | SpringerLink

Об этой книге

Введение

Том I содержит подробное обсуждение последних разработок компонентов биосенсора Crucical. Он концентрируется на интерфейсе между фазой анализируемого вещества и детектором, а именно на реализации новых элементов распознавания, включая нуклеиновые кислоты, и передовых технологий в создании чувствительных тонких слоев.Таким образом, читатель может получить представление о достижимом будущем прогрессе в этой области.

Ключевые слова

Analytik Bioanalytik Biochemie Biosensor Biosensoren analytics биоаналитика биохимия биосенсоры ферменты белки

Редакторы и филиалы

• Ф.W. Scheller
• F. Schubert
• J. Fedrowitz

1. 1.Institut für Biochemie und Molekulare Physiologie c / o Max-Delbrück-Center für Molekulare MedizinBerlinGermany für TechnikalischémanyChémany206 HochschulentwicklungGütersloh Германия

Библиографическая информация

• Название книги Границы биосенсорики I
• Подзаголовок книги Фундаментальные аспекты
• Редакторы Ф.W. Scheller
  F. Schubert
  J. Fedrowitz
  
• Название серии Дополнение Experientia
• DOI https://doi. org/10.1007/978-3-0348-9043-4
• Информация об авторских правах Биркхойзер Верлаг 1997
• Имя издателя Биркхойзер, Базель
• электронные книги Архив книг Springer
• Печатать ISBN 978-3-0348-9883-6
• Интернет ISBN 978-3-0348-9043-4
• Серия Печать ISSN 1664-431X
• Серия Интернет ISSN 2504-3692
• Номер издания 1
• Число страниц VI, 290
• Количество иллюстраций 0 ч / б иллюстраций, 0 цветных иллюстраций
• Темы Биотехнология
  Науки о жизни, общее
  Биомедицина, общее
  
• Купить эту книгу на сайте издателя

Citroen

Первый автомобиль Voisin был построен и испытан Габриэлем Вуазеном. Эксцентричный и непокорный, Габриэль Вуазен был пионером авиации, который стремился запечатлеть свое значительное эго в мире автомобилей. И почему бы ему не иметь эго? Не он ли, а не те американцы, Райты, первым пилотировал самолет? Разве его дизайн V-12 не указал Rolls-Royce на разработку собственного? Творения Вуазена были истинными зеркалами его души, одними из самых экстремальных, ярких и эстетически изысканных транспортных средств, которые когда-либо двигались своим ходом. Voisin — имя переводится как «сосед» — родился в Бельвиль-сюр-Сон, Франция, 5 февраля 1880 года, в семье инженера-литейщика Жоржа Вуазена.Он изучал архитектуру в Ecole des Beaux-Arts в соседнем Лионе и получил работу в парижской архитектурной фирме Godefroy & Freynet, но его голова витала в облаках — он интересовался полетами. Он оставил архитектуру, чтобы присоединиться к Эрнесту Архидиакону, главе Aviation Syndicate, а в 1904 году присоединился к своему брату Чарльзу и Луи Блерио, которые прославились как первый человек, совершивший перелет через Ла-Манш, захватив завод Surcouf Aviation в Бийанкуре. . Когда Блерио уехал в 1907 году, братья Вуазен основали Voisin Freres в пригороде Парижа Исси-ле-Мулино, первую в мире авиационную фирму.Вуазен построил самолет, который взлетал своим ходом и оставался в воздухе на высоте 250 футов в то время, когда самолетам Райта требовалась катапульта, чтобы подняться в воздух, что привело к его заявлению о создании первого настоящего летательного аппарата. В 1909 году в возрасте 29 лет он стал самым молодым рыцарем французского Почетного легиона. Семья Вуазен расширила свой бизнес и к 1911 году успешно продала 59 самолетов, хотя Габриэль сильно пострадал, когда Чарльз погиб в следующем году в автокатастрофе. Удача улыбнулась в 1914 году, когда Александр Миллер, военный министр Франции, выбрал Voisin в качестве стандартного самолета для французских ВВС.Завод был недостаточно велик, чтобы удовлетворить спрос, поэтому его бипланы строили другие производители самолетов, в том числе Breguet и Nieuport. Когда перемирие 1918 года положило конец большим заказам на авиацию, Вуазен превратил свои мечи на орала, превратив свой большой завод и 2000 сотрудников в производство автомобилей. Для своего первого автомобиля, названного C1 в честь его покойного брата, Вуазен купил готовую конструкцию, от которой отказались Citroën, потому что его 80-сильный двигатель Knight с клапаном на цилиндр сочли слишком дорогим в производстве.Эксцентричный или упрямый, когда Габриэль Вуазен выбрал конструкцию с клапаном-втулкой, он оставался с ней до конца производства, платя Чарльзу Найту гонорар за каждую единицу. Вуазен возился с другими идеями, в том числе с мотоциклом объемом 500 куб. См, который он назвал le Sulky, и дико экспериментальным C2, показанным на Парижском салоне в 1921 году. Его узкоугольный 7,2-литровый двигатель V-12 был шедевром сложности внутри, но триумф минимализма снаружи. Каждое колесо имело собственный замкнутый гидравлический контур, а сцепление состояло из двух обращенных друг к другу турбин в масляной ванне.«Это было слишком сложно и поэтому непомерно дорого производить на таком маленьком заводе, как наш», — признал Вуазен. За C1 последовал в производстве C3 с двигателем высокой степени сжатия мощностью 140 л. с. Voisin предложил вознаграждение в размере 500 000 франков каждому, кто сможет произвести двигатель такого же размера, который соответствовал бы эффективности и производительности Voisin, и никогда не должен был платить — никто не принял вызов. Затем последовали и другие модели, в том числе четырехцилиндровый C4, который обогнал Восточный экспресс из Парижа в Милан, и шестицилиндровый C11, самый коммерчески успешный из всех автомобилей Voisin.Он построил три автомобиля, приводимые в движение его двигателем V12L, рядный-12, который представлял собой две прямые шестерки, соединенные встык. Несмотря на его опыт работы в авиации, карьера Вуазена во многом обязана его более ранней карьере архитектора. Его конструкции были легкими, но вряд ли могли считаться аэродинамическими, их странные углы, плоскости и изгибы были вызваны больше кубизмом, чем аэродинамической трубой. Фактически, Вуазен поддерживал дружбу с модернистским архитектором Ле Корбюзье, который проектировал дверные ручки на ранних автомобилях и позже отстаивал идеи Вуазена о спланированном промышленном городе. Какими бы ни были его сильные стороны как инженера, Вуазен был плохим бизнесменом и часто выказывал свое пренебрежение к типичному автомобилисту. Тем, кто критиковал его машины, он посоветовал купить другую марку. Он презирал рекламу в американском стиле, которая ставила эмоции выше холодных фактов, и насмехался над теми, кто проглотил такую ​​рекламу. Депрессия тяжело пережила такую ​​компанию, как Voisin, которая обслуживала богатых и знаменитых, и Габриэль Вуазен потерял контроль над своей компанией в 1932 году, как и его соотечественник Андре Ситроен.Хотя он смог вернуть его в 1934 году, спустя три года он потерял его навсегда. Вуазен продолжал создавать, спроектировав алюминиевый микрокар под названием Biscooter после войны, и исследовал идеи для энергии пара. Необычный шестиколесный грузовик с двигателем объемом 200 куб. См, показанный на Парижском салоне 1958 года, стал последним автомобилем, носящим его имя. Он уехал в Турнус в 1960 году, чтобы написать свои мемуары, и получил постоянный поток посетителей, многие из которых хотели узнать о его довольно обширной личной жизни. (Разлученный со своей женой Адриенн Лола в 1926 году, он женился на испанке примерно 18 лет в 1950 году и основал дом с ней и ее старшей сестрой, которые «пришли как часть ее приданого.Он оставался близким к своей дочери от первого брака, Жанне. Вуазен хотел рассказать о своем месте в истории авиации и не проявлял интереса к своим автомобилям. «Зачем вы так возитесь со старыми черепками?» — спросил он посетителя. который прибыл в Voisin. «В вашем возрасте вы должны тратить свое время и деньги на хорошеньких девушек». Вуазен умер на Рождество 1973 года и был похоронен в деревне Ле Виллар, недалеко от места своего рождения.

Габриэль Вуазен

Показать статью

Vw Split Screen Safari Windows для продажи

Обратите внимание, что ошибки повреждают лицо на высоких скоростях. У меня есть регулярная работа 50 часов в неделю, и я делаю это по ночам и в выходные.

Vw окна сафари с разделенным экраном на продажу .

Vw s type 2 разрабатывался как простой и дешевый коммерческий автомобиль. Кемпер с разделенным экраном 1963 года. Водонепроницаемость окон Safari не гарантируется. Рядом с Эксетером Девон. Фольксваген автобус сафари окна. 1973 15 оконных комби. Построен на немецком заводе в 1959 году.Кемпер с разделенным экраном vw. 1958 потрясающий vw сплит-экран 11 окно на продажу 42500 прекрасный пример этого 1958-го дымчато-серого и кремового кемпера с раздельным экраном. Креативная инженерия — это семейный бизнес, которому уже 16 лет. 1963 г. автобус vw kombi 15 окно. Фургон vw с разделенным экраном 1965 года. 1960 vw сафари kombi автофургон с разделенным экраном на продажу 22500 Я обнаружил эту жемчужину в Солт-Лейк-Сити, США.Кемпер с разделенным экраном 1963 года, импортированный из Таиланда 10 лет назад. Был переделан верхняя половина и передняя панель. Правосторонний фургон в отличном состоянии. Стекло сафари немецкого качества для подлинной рамы прозрачное 55 67 made by cc все наше стекло сделано из стекла 5 мм с полностью отполированными краями от самой большой точки, это 60 см x 42 см, обратите внимание, что курьеры не будут страховать стекло, поэтому cc не может быть несет ответственность за любой ущерб.Vw 1964 автобус с правосторонним разделением экрана. Пожалуйста, ведите машину ответственно, если вы планируете ехать с открытыми дверьми. Это большие стеклянные секции, которые нельзя открывать. В феврале 2015 года по стране открылась пасть, когда на аукционе был продан Volkswagen kombi samba с окнами 23 модельного ряда 1960 года за 202000 рублей. Сафари созданы для шоу. Продается моя любовно полностью отреставрированная 64 оригинальная rhd сплит.Комплекты переднего стекла Safari для автобуса из необработанной стали 1955 67 с рамками, уплотнителями стекол, фурнитурой, антенной safari, часть 261 900 шт. Внешний кузов Syd с двухпортовым двигателем Harry harpic имеет передние окна сафари, боковые всплывающие окна, задние решетки и салон tmi.