Обзор лада х рей: обзор, новости, машина ВАЗ Лада Икс Рей — разные поколения, комплектации, характеристики Lada XRAY — сайт За рулем www.zr.ru

12 Проходимость

8 Мультимедиа

6 Шумоизоляция

6 Подвеска

4 Динамика

Минусы

13 минусов

7 Коробка передач

5 Вместительность салона

1 Обзорность

Все плюсы и минусы

LADA (ВАЗ) XRAY 1.6 MT (106 л.с.)

Владею Хрэй 2 года. По машине только положительные эмоции. Клиренс выполняет свои функции на отлично-даже на бордюр заезжаю без проблем. В лес, на дачу, за город без проблем. На трассе обгоны также бе

Машина компромис с собой

LADA (ВАЗ) XRAY 1.6 MT (110 л.с.)

Ну что сказать! ребята ваз он и в африке ваз ! нас снова поимели ,места в салоне мало ,ценники на запчасти конские ,комфорта просто ноль! что порадовало проходимость!печка жарит кондер дует неплохо ос

Тест-драйв Авто.ру

Пять вопросов к первой в истории Ладе с вариатором: тест Lada Xray Cross

Lada XRay

LADA (ВАЗ) XRAY 1.6 MT (106 л.с.)

Нисколько не пожалел о покупке данного авто. За 3 года ни разу не подвела. В своё время выбирал между Lada Xray и Renault Sandero stepway, и остановился на Xray, потому что в Sandero stepway не такая

Xray

LADA (ВАЗ) XRAY 1.8 AMT (122 л.с.)

Отличный авто, за 5 лет ничего с ним не делал, только ТО по регламенту. Двигателя хватает на всех обгонах, мотор очень экономичный, в городе расход 7.7литров. Зимой очень тепло в салоне. В целом автом

Подарок жене для покатушек в места с «неидеальной дорожной инфраструктурой»

LADA (ВАЗ) XRAY 1.8 AMT (122 л.с.)

Этим летом мы с женой нашли интересное место на черноморском побережье, где можно отдохнуть как мы любим. А любим мы, чтобы на пляже не приходилось толкаться локтями. В общем красота, отель в лесу, ус

capehorn

Обновлён

19 ноября 2020

Lada Xray 1.8 робот 2017

LADA (ВАЗ) XRAY 1.8 AMT (122 л.с.)

Здравствуйте! Решил спустя год владения несколько слов о машине написать. Для тех, кто может быть присматривается к этой модели. Покупал я ее б.у. с рук, после 1 хозяина. Машине на тот момент было 2.5

Очевидное-невероятное или предсказуемая-непредсказуемость

LADA (ВАЗ) XRAY 1.6 MT (110 л.с.)

Привет Земляне. Всем доброго. Решил себя заставить написать отзыв на моё свежее приобретение. Дабы не утруждать себя поиском литературных изысков постараюсь кратко и лаконично описать все плюсы и м

Красный бегемот.

LADA (ВАЗ) XRAY 1.8 AMT (122 л.с.)

В первую очередь — те, кто хочет срочно написать: «я на своем мерсе 1910 года переехал Годзиллу и только бампер помял» или там: «Только праворульная Субару с 1000 коней унизит всех и вся», а также :»я

Немного напрягает, но (ДОПОЛНЕНИЯ)

LADA (ВАЗ) XRAY 1.6 MT (106 л.с.)

Немного напрягает отношение диллеров. Читал отзыв Сереги про козырёк, писал коментарий, что с такой бедой и другими мелочами справляюсь сам, обещал фото. скидываю. Пусть такую сделает или клеит. Пробл

Удачный бюджетный СУВ-хэтчбэк

LADA (ВАЗ) XRAY 1.

После серьезнла аварии с моей десятилетней Киа Спектра зашел в салон Автоваза, Лада. Вначале хотел брать расхваленную Ладу Весту, но продавец подсказал, что Икс рей выше и вести его будет намного увер

Всё о LADA (ВАЗ) XRAY

Рейтинг модели — 4.3 / 5

LADA XRAY CROSS в Минске

Базовая программа, активирующаяся после запуска мотора. Единый комплекс настроек контроллера двигателя и электронных систем обеспечивает безопасность движения в критических ситуациях и наиболее эффективно помогает преодолевать крутые участки, особенно со смешанным типом дорожного покрытия. При сносе передней оси или заносе задней система регулирует скорость вращения каждого колеса в отдельности для выравнивания положения автомобиля.

Противобуксовочная система дает больше свободы ведущим колесам, позволяя энергично стартовать. Система контроля устойчивости менее чувствительно реагирует на снос автомобиля. При этом повышена чувствительность педали акселератора. Кнопка «Sport» отключает все другие режимы, сам же спортивный режим действует, пока водитель не отключит его или не перезапустит мотор. На автомобилях с АМТ предусмотрена отдельная кнопка «Sport»: в этом режиме повышенные передачи включаются позже, а пониженные – при ускорении – раньше. Кнопка «Sport» отключает все другие режимы, сам же спортивный режим действует, пока водитель не отключит его или не перезапустит мотор.

Система помогает больше пробуксовывать ведущим колесам, повышена чувствительность электронного дифференциала. Антиблокировочная система тормозов позволяет большее проскальзывание колес для повышения эффективности торможения на грунтовых дорогах и в снегу. Отключение функции «Снег/грязь» происходит автоматически при достижении скорости 54 км/ч.

Функция позволяет еще больше, чем в режиме «Снег/грязь», пробуксовывать ведущим колесам, чувствительность электронного дифференциала максимально увеличена. ABS дает еще большую возможность, чем в режиме «Снег/грязь», проскальзыванию колес для повышения эффективности торможения на грунтовых дорогах и в снегу. Отключение функции «Песок» происходит автоматически при достижении скорости 54 км/ч.

Тест-драйв Lada Xray Cross. Внедорожник наполовину

Короткие свесы, внушительный клиренс — чем не внедорожник! По крайней мере, внешне Xray Cross создает полную уверенность, что создан не только для асфальта.

Максим Федоров

Lada Xray Cross Цена: от 729 900 р. В продаже: с октября 2018 г.

Пластиковый обвес закреплен на клипсах (в кузовных панелях пробиты отверстия) и для надежности проклеен двусторонним скотчем.

Кто там топил за полный привод? Поставить его — не проблема, ведь в основе «Иксрея» та же платформа B0, что и у «Дастера». Но вы представляете, насколько при этом взлетит цена? А ведь Xray Cross и с передним приводом недешев. Хотя даже за такие деньги новинка АвтоВАЗа выгоднее одноклассников. Конкуренты либо дороже, либо оснащены хуже, а чаще и то, и другое. Не считая обвеса из некрашеного пластика, здесь уже в «базе» есть 17‑дюймовые легкосплавные диски, рейлинги, «двустволка» глушителя из нержавейки, светодиодные ходовые огни, сигнализация с центральным замком и задние дисковые тормоза — они, к слову, здесь от «Весты». Даже шины у новинки не бюджетные: сваренная по спецзаказу АвтоВАЗа всесезонка Continental размерности 215/50R17 шире и выше, чем у Vesta Cross. Она же лежит в багажнике в качестве полноразмерной запаски, причем на оригинальном литом диске.

Контрастные коричневые вставки в салоне можно заменить менее навязчивыми серыми.

Подушка заднего дивана отодвинута к багажнику на 2,5 см — эту доработку, позволившую добавить места для ног, получил и обычный Xray.

Высокопрофильные шины добавили к 195‑миллиметровому дорожному просвету хетчбэка 5 мм, а еще 15 мм удалось выиграть за счет новых пружин и амортизаторов. Причем на обычный «Иксрей» их так просто не поставить — придется менять передние рычаги и ШРУСы. Но делать это настоятельно не рекомендуем, поскольку как поедет такая машина, неизвестно. Ведь шасси Xray Cross настраивалось не только под новую подвеску, но и под новый электрический усилитель руля, поставленный взамен электрогидравлического, который позволил уменьшить передаточное отношение в рейке: от упора до упора руль теперь делает меньше трех оборотов.

— При создании «Кросса» в конструкцию Lada Xray было внедрено 170 новых узлов, а сам перечень изменений еще больше! — Олег Груненков, директор проекта Lada Xray Cross, поехавший с нами в Казахстан на первый тест-драйв новинки, явно гордился проделанной работой.

Действительно, перечень доработок получился большим, и реализовать удалось далеко не все задумки. Так, шумоизоляция хоть и была улучшена, но только на колесных арках и порогах: пескоструй теперь не слышно, но шум мотора и шин спокойно проникает в салон. Хотя на АвтоВАЗе нашу жалобу услышали. А что-то осталось нереализованным в силу конструктивных особенностей модели. Например, как ни старайся, а сделать машину просторнее, не увеличив колесную базу, не получится: и новые передние сиденья с глубокой выемкой под колени, а также отодвинутый ближе к багажнику и немного опущенный вниз задний диван лишь отчасти решили проблему тесноты на заднем ряду. Я с ростом 186 см помещаюсь сам за собой, хотя и без какого-либо запаса в ногах. Зато здесь теперь есть подогрев сидений и разъем USB-зарядки — далеко не в каждой модели более высокого класса встретишь такое.

Багажник — с двойным дном. Под ним полноразмерная запаска на литом диске.

На месте водителя также стало комфортнее: здесь наконец появился центральный подлокотник, а руль получил регулировку по вылету (впервые среди моделей на шасси B0!) и подогрев. Среди других новшеств — подогрев передних сидений с тремя степенями «прожарки», кнопки которого переехали c боковины сиденья на центральную консоль, и теперь понятно, в каком режиме он работает. Здесь же расположены кнопка включения подогрева лобового стекла и главная фишка новинки — регулятор системы Lada Ride Select, благодаря которой «Иксрей» ведет себя совсем по-другому как на дорогах с твердым покрытием, так и на бездорожье.

На крыше появились рейлинги (для их установки пришлось внедрять дополнительный штамп) и «плавник» антенны.

У системы четыре режима работы. Кнопкой Sport меняется скорость отклика на нажатие педали газа, а также немного «распускается» система стабилизации, позволяя поскользить в повороте. Скольжение испытать не удалось, а вот более отзывчивый акселератор здорово помогал как при езде в городе, так и при обгонах на трассе: с ним у мотора 1.8 словно открывалось второе дыхание (сюда бы еще 6‑ю передачу!). Здесь же есть регулятор с пиктограммами, обозначающими режимы «снег» и «песок», хотя первый можно использовать не только в снегу, но и в грязи, а второй — на гравии. Обе программы позволяют имитировать блокировку дифференциала путем подтормаживания ведущих колес и ограничивать вмешательство системы стабилизации. При необходимости стабилизацию можно полностью отключить, но, как и в первых двух случаях, при разгоне выше 58 км/ч система ESC «проснется». Впрочем, потерять управление на скользком покрытии можно и на меньшей скорости, поэтому пользоваться этими режимами нужно аккуратно.

«Давай, давай, родная!» — подбадривал я Lada Xray Cross, полировавшую колесами заснеженный подъем у гостиницы в предгорье Тянь-Шаня. Но вот колеса наконец нашли зацеп, и мы заползли на вершину, хотя я до последнего не верил, что смогу забраться. До этого уже пришлось отступать: при стандартных настройках машина могла забраться лишь до середины подъема, но с активированным режимом «снег» все пошло гораздо веселее. Машина буксовала, но шла! Конечно, Lada Ride Select — это не замена полному приводу, но то, что система расширяет возможности машины и помогает преодолевать сложные участки — факт. В испещренном рытвинами русле высохшей реки, по которому мы проехали до снегопада, проходимость машины ограничивала разве что цеплявшаяся за грунт выступающая «губа» переднего бампера. И тем не менее все равно найдутся скептики, которые скажут, что это очередной «развод» маркетологов. Но АвтоВАЗ никому не навязывает Lada Ride Select — Xray Cross можно взять и без нее.

Жаль только, что производитель не предоставляет возможности выбора двигателя, а 122‑сильный 1.8 отличается повышенным аппетитом не только к бензину (у нас средний расход составил 12,4 литра — это много даже с учетом продолжительных стоянок с заведенным мотором), но и, судя по отзывам владельцев, к маслу. Да и перечень трансмиссий на старте продаж будет ограничен: версия с обновленным «роботом» версии 2.0 появится позднее. Автомат? Вариатор? Нет, не слышали. Впрочем, наш народ этим не напугаешь: судя по статистике продаж других моделей Lada, версию «Кросс» выберет каждый второй покупатель «Иксрея».

Технические характеристики Lada Xray Cross 1.8 MT
Габариты	4171x1810x1645 мм
База	2592 мм
Снаряженная масса	1295 кг
Клиренс	215 мм
Объем багажника	361 л
Объем топливного бака	50 л
Двигатель	бензиновый, 4-цилиндровый, 1800 см3, 122 л. с. при 6050 мин-1, 170 Нм при 3700 мин-1
Трансмиссия	5-ступенчатая, привод передний
Размер шин	215/50R17
Динамика	180 км/ч; 10,9 с до 100 км/ч
Расход топлива (город/трасса/смешан.)	9,7/6,3/7,5 л на 100 км
Конкуренты	Hyundai Creta — от 904 900 р., Kia Rio X-Line — от 824 900 р., Renault Duster — от 689 900 р.

• Стильный внешний вид, отличная геометрическая проходимость, хорошо настроенное шасси.
• Прожорливый мотор, в МКП не хватает 6-й передачи, недостаточная шумоизоляция салона.

Вердикт

«Кросс» — это не просто попытка малой кровью сделать подобие внедорожника из обычного хетчбэка. Для АвтоВАЗа это еще и «работа над ошибками», в которой они постарались учесть отзывы и пожелания владельцев «Иксрея». Правда, большинство этих доработок так и останутся «эксклюзивом» версии Cross и на обычный Xray не попадут.

Хочу получать самые интересные статьи

Видео обзоры Лада Х рей 2018 года

Текстовые тест-драйвы Лада Х рей см. тут

Видео тест драйв Лада Веста Кросс тут: http://www.lada-xray2.ru/video-lada-xray-2015-goda

Большой тест драйв от Сергея Стиллавина и Рустама Вахидова: три для они тестировали Икс Рей (1.8 л.) в Сочи. Видео на 41 минуту.

{loadposition adsense2}

Итог ресурсных испытаний издания Авторевю: как будет чувствовать себя Х рей после 100 000 км. пробега. Сокрашенная видео версия. Полный текст тут.

{loadposition direct5}

Обзор Lada Xray с мотором 1.8/122 л.с. на «роботе» от популярного youtube блогера Елены Лисовской, автора канала «Лиса рулит»

{loadposition direct4}

Тест-драйв нового Икс Рей 2017 года от журнала «За рулем»

Обзор хэтчбека от портала auto.mail.ru

Видео обзор Xray от журнала Авторевю

Первый видео тест драйв практически серийной Лада Х рей от Автовестей и Павла Блюденова (расширенная версия на 48 минут)

Lada Xray против своего брата Renault Sandero Stepway. Стоит ли переплачивать за Х рей если за меньшие деньги можно взять французский хэтчбек? Сравнительный тест драйв от «Авторевю»

Сравнительный тест 10 автомобилей от «Авторевю». Примечателен он тем, как Xray справляется с легкой снежной целиной при том что на хэтчбеке установлена не отключаемая антипробуксовочная система (этот момент показан с 8:15 минут). Забегая вперед стоит сказать — Икс Рей единственный автомобиль который не справился с тестом. Как говорят на АвтоВазе, инжинеры знают об этом промахе и летом появится Х рей с отключаемой антипробуксовочной системой.

С октября 2016 года АвтоВАЗ наконец-то снабдил Х рей кнопкой отключения антипробуксовочной системы и в честь этого выпустил даже видео ролик, демонстрирующий внедорожные способности хэтчбека:

Видео полноприводного Lada Xray Cross 4х4 пока нет, ожирается тесты появятся в 2016-2107 годах.

Видео краш тест Лада Х рей

Краш тест хэтчбека пока не проводился, традиционно ждем его от журнала «Авторевю».

Видео тест драйв Лада Веста Кросс

Официально Vesta Cross пока не представлен, поэтому нет и его видео. Ниже рекламный ролик Лада Веста Кросс концепт:

Официальное видео Lada Xray (концепт)

Новинки АвтоВаза: Лада Хрей, Веста и Веста WTCC в одном видео

Видео презентации Лады Х рей и Лады Веста на Московском автосалоне 2014

Презентацию ведет лично президент АвтоВаза Бу Андерссон

Автоцентр «ЛИГА» — официальный дилер LADA в Хмельницком

Кроссовер LADA XRAY создан для тех, кто не привык теряться в толпе. Быть выше, быть ярче, быть заметней, быть свободным – это стиль тех, кто выбирает LADA XRAY. Максимум впечатлений уже ждёт Вас за рулём LADA XRAY!

Рельефная поверхность крыльев и дверей подчеркивает динамичный стиль уверенного в себе кроссовера. Автомобиль с развитой «мускулатурой» преуспевает во всех дисциплинах: скоростная поездка по трассе, маневрирование в тесноте города, уверенное движение по грунту, снегу и неровностям урбанистического пейзажа.

Двигатели и коробка передач Lada X-Ray

Два варианта мотора позволяет выбрать LADA XRAY в соответствии с собственными потребностями в динамике. Двигатель мощностью 106 л.с. оснащается механической трансмиссией, а для наиболее мощного, 122-сильного мотора предлагается также автоматизированная трансмиссия (АМТ).

Двигатель	Трансмиссия	Мощность	Расход топлива
1,6 л 16-кл.	5-ти ступенчатая механическая	106 л.с.	7,0 л / 100 км
1,8 л 16-кл.	5-ти ступенчатая механическая	122 л. с.	7,4 л / 100 км
1,8 л 16-кл.	5-ти ступенчатая автоматическая	122 л. с.	6,8 л / 100 км

АМТ, сочетающая функционал «механики» и «автомата», создана для России, поэтому ее работоспособность не зависит от температуры на улице. АМТ обладает полным функционалом механической коробки передач, включая торможение двигателем и возможность выехать «враскачку» из сугроба. В отличие от всех других вариантов трансмиссии, АМТ экономит топливо, продлевает ресурс автомобиля, а кроме того, она значительно доступней других автоматических коробок передач.

Динамика Lada X-Ray

LADA XRAY – это комфортная и высокая посадка, особенно удобная в городе и на легком бездорожье, динамичный мотор, острая управляемость, хорошая шумоизоляция. Подвеска автомобиля настроена на активное маневрирование: газонаполненные амортизаторы и передний подрамник обеспечивают отличный контроль над дорогой. Высокий внедорожный клиренс вместе с энергоемким, беспробойным шасси гарантируют отличную проходимость.

Комфорт Lada X-Ray

В салоне — набор ниш и подстаканников, карманы в обивках дверей, выдвижной контейнер под передним пассажирским сиденьем, охлаждаемый перчаточный ящик. В багажнике – крепления для сетки, пластиковые ниши за арками задних колес. Двойной пол в багажном отделении при сложенных задних сиденьях образует ровную площадку – это значительно облегчает транспортировку вещей всех форм и размеров. Заднее сиденье складывается в пропорции 60/40, что позволяет при необходимости перевозить габаритный груз.

Безопасность Lada X-Ray

Активная безопасность

За активную безопасность автомобиля отвечает функция курсовой устойчивости ESC.

Интеллектуальная система предотвращает занос автомобиля и включает ряд необходимых опций безопасности:

• антиблокировочная система тормозов (ABS): в случае экстренного торможения сохраняет управляемость автомобиля;
• усилитель экстренного торможения (BAS): при резком нажатии на педаль тормоза система автоматически повышает давление в тормозной магистрали, максимально эффективно замедляя автомобиль;
• противобуксовочная система (TCS): обеспечивает динамичный старт на скользком или неоднородном покрытии, а в случае пробуксовки одного из колес система выполняет функцию блокировки дифференциала;
• система распределения тормозных усилий (EBD): оптимально делит усилия между осями, предотвращая занос.

Пассивная безопасность

В каждом LADA XRAY – подушка безопасности водителя и пассажира, передние ремни безопасности с механизмом предварительного натяжения и ограничителем нагрузки.

Для комфортной и безопасной перевозки юных пассажиров LADA XRAY оснащен системой крепления детских кресел ISOFIX и блокировкой задних дверей.

Безопасный автомобиль – тот, который заметен на дороге. LADA XRAY никогда не потеряется в потоке, благодаря ярким светодиодным дневным ходовым огням. Светодиодная полоска выполняет и стилевую функцию, подсвечивая хромированный «Икс» передка.

Адаптация к зиме

• двусторонняя оцинковка наружных панелей кузова;
• антикор днища и скрытых полостей кузова;
• увеличенный до 195 мм дорожный просвет;
• энергоемкая подвеска;
• шины с высотой профиля, оптимальной как на асфальте, так и на грунте;
• эффективный воздушный фильтр салона;
• проверенная временем платформа B0 – это надежное шасси, отработанная электроника, тщательно просчитанные силовые элементы кузова;
• пластиковая облицовка и резиновые уплотнители порогов: надежная изоляция от загрязнений.

Габариты Lada X-Ray

FRET позволяет визуализировать отдельные молекулы.

Используя флуоресцентные маркеры, исследователи разработали резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) для визуализации сборки, функций и взаимодействий молекул.

Новый метод оптической визуализации был разработан исследователями, использующими Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) для наблюдения за действующей единственной молекулой, в Научном колледже Университета Клемсона, США, в сотрудничестве с учеными из Университета Генриха Гейне в Германии.

Команда предполагает, что их метод, основанный на флуоресценции, может ускорить развитие области структурной биологии, помогая исследователям лучше понять, как молекулы собираются, функционируют и взаимодействуют, что, в свою очередь, может помочь в разработке лекарств на основе структуры.

Ученые использовали FRET для изучения лизоцима бактериофага Т4, который, по их словам, лежит в основе основных этапов реакции биомолекулярных машин (ферментов).

«Наши исследования FRET демонстрируют необходимость третьего функционального состояния в знаменитой кинетике Михаэлиса-Ментен», — сказал соавтор Клаус Зайдель, председатель Института молекулярной физической химии в Университете Генриха Гейне.«Описание Михаэлиса-Ментен — одна из самых известных моделей кинетики ферментов».

Команда помогает создать базу данных, в которой их структурные модели аналогичных созданных биомолекулярных моделей на основе FRET могут быть сохранены и доступны другим ученым »

Центральным элементом этого инструмента визуализации является микроскоп на основе FRET, сложный и мощный машина, способная визуализировать биомолекулы размером всего несколько нанометров.

Чтобы увидеть биомолекулы в действии, команда поместила два флуоресцентных маркера на набор молекул, которые создали линейку на молекулярном уровне.Используя разные местоположения маркеров, команда собрала набор расстояний, которые описывают форму и форму наблюдаемой молекулы.

По сути, этот процесс генерировал набор точек данных, которые были обработаны с помощью вычислений, что позволило исследователям различать, как выглядит молекула и как она движется.

«Мы наблюдаем изменения в структуре, и поскольку наш сигнал зависит от времени, мы также можем получить представление о том, как молекула движется с течением времени», — сказал ведущий исследователь Уго Санабриа, доцент физики и астрономии в Клемсоне.

В исследовании Санабриа и его команда объединили микроскоп на основе FRET с молекулярным моделированием, чтобы изучить лизоцим, фермент, обнаруженный в слезах и слизи. Лизоцим разрушает защитные углеводные цепи, окружающие клеточную стенку бактерий. Ученые широко используют лизоцим для изучения структуры и функции белков, потому что это такой стабильный фермент.

«Мы можем отслеживать лизоцим бактериофага Т4, поскольку он обрабатывает свой субстрат почти на атомистическом уровне с беспрецедентным пространственным и временным разрешением», — сказал Санабриа. «Мы подняли область визуализации на совершенно новый уровень».

Новый оптический метод показал, что структура лизоцима отличается от ранее предполагавшейся. До сих пор ученые в основном определяли структуру белков, таких как лизоцим, в основном с помощью таких методов, как рентгеновская кристаллография, спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и криоэлектронная микроскопия.

«Долгое время эта молекула считалась молекулой с двумя состояниями из-за того, как она получает субстрат или клеточную стенку бактерий-мишеней», — сказал он.«Однако мы определили новое функциональное состояние».

Команда помогает создать базу данных, в которой их основанные на FRET структурные модели аналогичных биомолекулярных моделей могут быть сохранены и доступны другим ученым. Они также работают над разработкой рекомендаций по микроскопии FRET вместе с другими учеными FRET.

«Этот оптический метод можно использовать для изучения сворачивания и неправильного сворачивания белков или любой структурной организации биомолекул», — сказал Санабриа. «Его также можно использовать для скрининга и разработки лекарств, что требует знания того, как выглядит биомолекула, чтобы лекарство нацелилось на нее.

«Эта работа является важной вехой в определении структуры с использованием FRET для картирования короткоживущих функционально релевантных состояний ферментов», — заключил Зайдель.

Исследование было опубликовано в Nature Communications.

Введение в применение FRET в биологических экспериментах с одиночными молекулами

[1]	Селвин, П. Р., 2000, Возрождение резонансной передачи энергии флуоресценции., Nat. Struct. Биол., 7 (9), 730–734.
[2]	Förster, V.Т., 1946, Energiewanderung und Fluoreszenz., Die Naturwissenschaften, 33 (6), 166–175.
[3]	Страйер, Л., и Хогланд, Р. П., 1967, Передача энергии: спектроскопическая линейка, Proc. Natl. Акад. Sci. США, 58 (2), 719–726.
[4]	Хаас, Э. , Качальски-Кацир, Э., Стейнберг, И. З., 1978, Влияние ориентации донора и акцептора на вероятность передачи энергии с участием электронных переходов смешанной поляризации., Биохимия, 17 (23), 5064–5070.
[5]	Траутман, Дж. К., Маклин, Дж. Дж., Брус, Л. Е., Бетциг, Е., 1994, Спектроскопия одиночных молекул в ближнем поле при комнатной температуре., Nature, 369, 40–42.
[6]	Се, X. С., и Данн, Р. С., 1994, Исследование динамики одиночных молекул., Science, 265, 361–364.
[7]	Амброуз, У. П., Гудвин, П. М., Мартин, Дж. К., Келлер, Р. А., 1994, Детектирование одиночных молекул и фотохимия на поверхности с использованием оптического возбуждения в ближнем поле., Phys. Rev. Lett., 72 (1), 160–163.
[8]	Маклин, Дж. Дж., Траутман, Дж. К., Харрис, Т. Д., Брус, Л. Е., 1996, Визуализация и спектроскопия с временным разрешением одиночных молекул на границе раздела. , Science, 272, 255–258.
[9]	Траутман, Дж. К., Маклин, Дж. Дж., 1996, Спектроскопия одиночных молекул с временным разрешением с использованием оптики ближнего и дальнего поля, Chem. Phys., 205 (1-2), 221–229.
[10]	Фунацу, Т., Харада, Ю., Токунага, М., Сайто, К., Янагида, Т., 1995, Визуализация отдельных флуоресцентных молекул и индивидуальных оборотов АТФ отдельными молекулами миозина в водном растворе., Nature, 374, 555–559.
[11]	Сасе, И., Мията, Х., Корри, Дж. Э., Крейк, Дж. С., Киносита, младший, К., 1995, Визуализация в реальном времени отдельных флуорофоров на движущемся актине с помощью эпифлуоресцентного микроскопа ., Biophys. J., 69 (2), 212–218.
[12]	Шмидт, Т., Schuetz, G.J., Баумгартнер, W., Gruber, H.J., Schindler, H., 1995, Характеристика фотофизики и подвижности одиночных молекул в жидкой липидной мембране. , J. Phys. Chem., 99 (49), 17662–17668.
[13]	Диксон, Р.М., Норрис, Д.Дж., Ценг, Й.-Л., Моернер, В.Е., 1996, Трехмерное изображение одиночных молекул, сольватированных в порах поли (акриламидных) гелей., Science , 274, 966–968.
[14]	Ни, С., Чиу, Д. Т., Заре, Р.Н., 1994, Исследование отдельных молекул с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии., Science, 266, 1018–1021.
[15]	Келлер, Р. А., Амброуз, У. П., Гудвин, П. М., Джетт, Дж. Х., Мартин, Дж. С., Ву, М., 1996, Анализ флуоресценции одиночных молекул в растворе., Appl. Spectrosc., 50 (7), 12А – 32А.
[16]	Ha, T., Enderle, T., Ogletree, DF, Chemla, DS, Selvin, PR, Weiss, S., 1996, Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: передача энергии резонанса флуоресценции между одним донором и одним акцептором., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 93 (3), 6264–6268.
[17]	Ha, T., Ting, AY, Liang, J., Caldwell, WB, Deniz, AA, Chemla, DS, Schultz, PG, Weiss, S., 1999, Single-молекулярная флуоресценция спектроскопия конформационной динамики ферментов и механизма расщепления., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 96 (3), 893–898.
[18]	Ха, Т., Чжуанг, X., Ким, Х. Д., Орр, Дж. У., Уильямсон, Дж. Р., Чу, С., 1999, Индуцированные лигандом конформационные изменения, наблюдаемые в одиночных молекулах РНК., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 96 (16), 9077–9082.
[19]	Цзя, Ю., Талага, Д.С., Лау, В.Л., Лу, HSM, ДеГрадо, В.Ф., Хохштрассер, Р.М., 1999, Динамика складывания одиночных пептидов GCN-4 с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии конфокальной микроскопия., Chem. Phys., 247, 69–83.
[20]	Фрис, Дж. Р., Бранд, Л., Эггелинг, К., Кёльнер, М., Зайдель, К. А. М., 1998, Количественная идентификация различных отдельных молекул с помощью селективной конфокальной флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением. , J. Phys. Chem. А, 102 (33), 6601–6613.
[21]	Дениз, А.А., Дахан, М., Грюнвелл, Дж. Р., Ха, Т., Фаулхабер, А.Е., Хемла, Д.С., Вайс, С., 1999, Перенос энергии резонанса однопарной флуоресценции на свободно диффундирующие молекулы: наблюдение зависимости Фёрстера от расстояния и субпопуляции., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 96 (7), 3670–3675.
[22]	Дахан, М., Дениз, А. А., Ха, Т., Хемла, Д. С., Шульц, П. Г., Вайс, С., 1999, Ратиометрическое измерение и идентификация одиночных диффундирующих молекул., Chem. Физ., 247 (1), 85–106.
[23]	Дениз, А.А., Лоуренс, Т.А., Белигер, Г.С., Дахан, М., Мартин, А.Б., Хемла, Д.С., Доусон, П.Е., Шульц, П.Г., Вайс, С., 2000, Сингл сворачивание белка -молекулы: исследования диффузионного флуоресцентного резонансного переноса энергии денатурации ингибитора химотрипсина 2. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 97 (10), 5179–5184.
[24]	Сако, Ю. , Миногучи, С., Янагида, Т., 2000, Одномолекулярная визуализация передачи сигналов EGFR на поверхности живых клеток., Nat. Cell Biol., 2 (3), 168–172.
[25]	Weiss, S, 1999, Флуоресцентная спектроскопия одиночных биомолекул., Science, 283, 1676–1683.
[26]	Ha, T, 2001, Перенос энергии резонанса флуоресценции одиночных молекул., Методы, 25 (1), 78–86.
[27]	Рой, Р., Хонг, С., Ха, Т., 2008, Практическое руководство по одномолекулярному FRET., Nat. Методы, 5 (6), 507–516.
[28]	Дж.Р. Лакович, Принципы флуоресцентной спектроскопии, 3-е изд., Нью-Йорк, США: Springer, 2006.
[29]	Макканн, Дж. Дж., Чой, У. Б., Чжэн, Л., Венингер, К., Боуэн , ME, 2010, Методы оптимизации для восстановления абсолютной эффективности FRET от иммобилизованных одиночных молекул., Biophys. J., 99 (3), 961–970.
[30]	Окамото, К., Сако, Ю., 2012, Вариационный байесовский анализ фотонной скрытой марковской модели для траекторий FRET одиночных молекул., Biophys. J., 103 (6), 1315–1324.
[31]	Hanson, J. A. и Yang, H., 2008, Количественная оценка взаимной корреляции между двумя временными рядами конечной длины с приложениями к FRET одиночных молекул, J. Phys. Chem. В, 112 (44), 13962–13970.
[32]	Шулер, Б., Липман, Э. А., Итон, В. А., 2002, Исследование поверхности свободной энергии для сворачивания белка с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул, Nature, 419, 743–748.
[33]	Гопич, И.В., Сабо А., 2003, Перенос энергии резонанса флуоресценции одиночной макромолекулы и профили свободной энергии. // J. Phys. Chem. В, 107 (21), 5058–5063.
[34]	Гопич, И. В., Сабо, А. , 2007, Одномолекулярный FRET с диффузией и конформационной динамикой., J. Phys. Chem. В, 111 (44), 12925–12932.
[35]	Букобза, Э., Зонненфельд, А., Харан, Г., 2001, Иммобилизация в липидных везикулах, привязанных к поверхности, как новый инструмент для спектроскопии отдельных биомолекул., J. Phys. Chem. В, 105 (48), 12165–12170.
[36]	Окамото, К., и Теразима, М., 2008, Анализ распределения для измерения FRET одиночных молекул., J. Phys. Chem. В, 112 (24), 7308–7314.
[37]	Капанидис, А.Н., Ли, Н.К., Лоуренс, Т.А., Дуз, С., Марджит, Э., Вайс, С., 2004, Сортировка молекул с помощью флуоресценции: Анализ структуры и взаимодействий с помощью переменно-лазерное возбуждение одиночных молекул., Тр. Natl.Акад. Sci. США, 101 (24), 8936–8941.
[38]	Терентьева, Т.Г., Энгелькамп, Х., Роуэн, А.Е., Комацузаки, Т., Хофкенс, Дж. , Ли, Ч.-Б., Бланк, К., 2012, Динамическое расстройство в одноферментные эксперименты: факты и артефакты., ACS Nano, 6 (1), 346–354.
[39]	Лю, Й., Парк, Дж., Дамен, К.А., Чемла, Ю.Р., Ха, Т., 2010 г., Сравнительное исследование многомерного и одномерного скрытого марковского моделирования в одно- анализ данных молекулы FRET., J. Phys. Chem. В, 114 (16), 5386–5403.
[40]	МакКинни, С. А., Джу, К., Ха, Т., 2006, Анализ траекторий FRET одиночных молекул с использованием скрытого марковского моделирования., Biophys. J., 91 (5), 1941–1951.
[41]	Бронсон, Дж. Э., Фей, Дж., Хофман, Дж. М., Гонсалес-младший, Р.Л., Виггинс, К.Х., 2009, Скорость обучения и состояния на основе биофизических временных рядов: байесовский подход к выбору модели и одномолекулярные данные FRET., Biophys. Дж., 97 (12), 3196–3205.
[42]	Xu, CS, Kim, H. , Hayden, CC, Yang, H., 2008, Совместный статистический анализ многоканальных временных рядов из одной квантовой точки — (Cy5) n конструкций ., J. Phys. Chem. В, 112 (19), 5917–5923.
[43]	Ensign, D. L., и Pande, V. S., 2010, Байесовское обнаружение изменений интенсивности в траекториях одиночных молекул и молекулярной динамики., J. Phys. Chem. В, 114 (1), 280–292.
[44]	Баба А., Комацузаки Т., 2007, Построение эффективного ландшафта свободной энергии из временных рядов одиночных молекул, Proc. Natl. Proc. Sci. США, 104 (49), 19297–19302.
[45]	Пирчи, М., Зив, Г., Ривен, И., Коэн, С.С., Зохар, Н., Барак, Ю., Харан, Г., 2011, Флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул картирует складчатый ландшафт большого белка., Nat. Commun., 2, 493.
[46]	Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M. , Eaton, W. A., 2005, Полипролин и «спектроскопическая линейка», пересмотренные с помощью флуоресценции одиночных молекул., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 102 (8), 2754–2759.
[47]	МакКинни, С.А., Деклайс, А.-К., Лилли, Д.М. Дж., Ха, Т., 2003, Структурная динамика отдельных узлов Холлидея., Nat. Struct. Биол., 10 (2), 93–97.
[48]	Hohng, S., Joo, C., Ha, T., 2004, Одномолекулярный трехцветный FRET., Biophys. J., 87 (2), 1328–1337.
[49]	Sarkar, SK, Andoy, NM, Benítez, JJ, Chen, PR, Kong, JS, Chen, CH, 2007, Конструированные соединения Холлидея как одномолекулярные репортеры для взаимодействий белок-ДНК с применением регулятору семейства MerR., J. Am. Chem. Soc., 129 (41), 12461–12467.
[50]	Карымов М.А., Чиннарай М., Богданов А., Сринивасан А.Р., Чжэн Г., Олсон В.К., Любченко Ю.Л., 2008, Структура, динамика и отраслевая миграция соединение Холлидея ДНК: исследование флуоресценции и моделирования одной молекулы. , Biophys. J., 95 (9), 4372–4383.
[51]	Blanchard, S.C., Gonzalez Jr., R. L., Kim, H. D., Chu, S., Puglisi, J. D., 2004, Выбор тРНК и кинетическая корректура в переводе., Nat. Struct. Мол. Биол., 11 (10), 1008–1014.
[52]	Blanchard, S.C., Kim, H.D., Gonzalez Jr., R.L., Puglisi, J.D., Chu, S., 2004, динамика тРНК на рибосоме во время трансляции., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 101 (35), 12893–12898.
[53]	Роудс, Э., Коэн, М., Шулер, Б., Харан, Г., 2004, Сворачивание в двух состояниях, наблюдаемое в отдельных белковых молекулах., J. Am. Chem. Soc., 126 (45), 14686–14687.
[54]	Мерчант, К. А., Бест, Р. Б., Луис, Дж. М., Гопич, И. В., Итон, В. А., 2007, Характеристика развернутых состояний белков с использованием спектроскопии FRET одиночных молекул и молекулярного моделирования., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 104 (5), 1528–1533.
[55]	Чанг, Х. С., Луис, Дж.M., Eaton, W.A., 2009, Экспериментальное определение верхней границы времени перехода в сворачивании белка по траекториям фотон за фотоном одной молекулы., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 106 (29), 11837–11844.
[56]	Уоршоу, Д.М., Кеннеди, Г.Г., Уорк, С.С., Кременцова, Е.Б., Бек, С., Трибус, К.М., 2005, Дифференциальная маркировка головок миозина V с помощью квантовых точек позволяет напрямую визуализировать руку -внешняя процессивность., Биофиз. J., 88 (5), L30– L32.
[57]	Tomishige, M., Stuurman, N., Vale, R. D., 2006, Одномолекулярные наблюдения конформационных изменений шейного линкера в моторном белке кинезина., Nat. Struct. Мол. Биол., 13 (10), 887–894.
[58]	Ясуда, Р., Масайке, Т., Адачи, К., Нодзи, Х., Ито, Х., Киносита, младший, К., 2003, Конформация АТФ-ожидания вращающаяся F1-АТФаза, обнаруженная с помощью парного резонансного переноса энергии флуоресценции. , Proc. Natl. Акад. Sci.США, 100 (16), 9314–9318.
[59]	Козука, Дж., Йокота, Х., Араи, Ю., Исии, Ю., Янагида, Т., 2006, Динамический полиморфизм отдельных молекул актина в актиновой нити., Nat. Chem. Биол., 2 (2), 83–86.
[60]	Hanson, JA, Duderstadt, K., Watkins, LP, Bhattacharyya, S., Brokaw, J., Chu, J.-W., Yang, H., 2007, Illuminating the Mechanistic роли ферментов конформационной динамики., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 104 (46), 18055–18060.
[61]	He, Y., Li, Y., Mukherjee, S., Wu, Y., Yan, H., Lu, HP, 2011, Исследование конформационного состояния активного центра одномолекулярного фермента прерывистая когерентность., J. Am. Chem. Soc., 133 (36), 14389–14395.
[62]	Бережна, С. Ю., Гилл, Дж. П., Ламичхейн, Р., Миллар, Д. П., 2012, Одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера обнаруживает врожденную контрольную точку верности в ДНК-полимеразе I. , J. Am. Chem. Soc., 134 (27), 11261–11268.
[63]	Мюллер-Шпет, С., Соранно, А., Хиршфельд, В., Хофманн, Х., Рюеггер, С., Реймонд, Л., Неттельс, Д., Шулер, Б. , 2010, Зарядовые взаимодействия могут доминировать над размерами внутренне неупорядоченных белков., Proc. Natl. Акад. Soc. США, 107 (33), 14609–14614.
[64]	Murakoshi, H., Iino, R., Kobayashi, T., Fujiwara, T., Ohshima, C., Yoshimura, A., Kusumi, A., 2004, Визуализация одиночных молекул анализ активации Ras в живых клетках., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 101 (19), 7317–7322.
[65]	Huppa, JB, Axmann, M., Mörtelmaier, MA, Lillemeier, BF, Newell, EW, Brameshuber, M., Klein, LO, Schütz, GJ, Davis, MM, 2010, TCR Взаимодействия -пептид-MHC in situ демонстрируют ускоренную кинетику и повышенное сродство., Nature, 9, 963–967.
[66]	Хибино, К., Шибата, Т., Янагида, Т. , Сако, Ю., 2009, Конформационное изменение, индуцированное RasGTP, в C-RAF важно для точного молекулярного распознавания., Biophys. J., 97 (5), 1277–1287.
[67]	Сакон, Дж. Дж., И Венингер, К. Р., 2010, Определение конформации индивидуальных белков в живых клетках., Nat. Методы, 7 (3), 203–205.

Сравнение кристаллографии, ЯМР и ЭМ

1. Дом

Структурная биология включает методы и принципы молекулярной биологии, биохимии и биофизики как средства выяснения молекулярной структуры и динамики биологически значимых молекул.Недавний прогресс в приборостроении подтвердил новый импульс в структурной биологии, поскольку сложные биологические молекулы теперь можно анализировать с беспрецедентной легкостью и эффективностью. Трехмерная структура белков и белковых комплексов позволяет лучше понять законы жизнедеятельности и механизм заболеваний, что позволяет рационально разрабатывать новые диагностические и терапевтические средства. Существует три основных метода исследования структурной биологии: дифракция рентгеновских лучей на монокристаллах (SC-XRD), ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и криоэлектронная микроскопия (Cryo-EM).Однако универсального метода не существует, поскольку все три метода обладают уникальными преимуществами, а также ограничениями.

Рисунок 1. Три основных метода исследования структурной биологии. Согласно статистике PDB (https://www.rcsb.org/), с помощью SC-XRD было разрешено более 120 000 белковых структур, что составляет почти 90% от общего числа. И есть около 12000 белковых структур, полученных с помощью ЯМР. Хотя общее количество белковых структур, разрешенных с помощью Cryo-EM, несопоставимо с таковым при использовании первых двух методов, в последние годы заметен взрывной рост структур с помощью этого метода.

1. Монокристалл Дифракция рентгеновских лучей

Рентгеновская кристаллография использует рентгеновские лучи для определения положения и расположения атомов в кристалле. Самый классический метод рентгеновской кристаллографии — это дифракция рентгеновских лучей на монокристаллах, при которой атомы кристаллов заставляют падающий рентгеновский луч производить рассеянные лучи. Когда рассеянные лучи попадают на детектор, эти лучи создают спекл-дифракционную картину. По мере постепенного поворота кристалла можно измерить угол и интенсивность этих дифрагированных лучей, а затем создать трехмерное изображение электронной плотности внутри кристалла.На основе этой электронной плотности можно определить среднее положение атомов в кристалле, химические связи, кристаллические барьеры и различную информацию. Для монокристалла с достаточной чистотой, однородностью и регулярностью данные дифракции рентгеновских лучей могут определять средний угол химической связи и длину с точностью до нескольких десятых градуса и нескольких тысячных долей ангстрема соответственно.

Рис 2. Физические и математические принципы рентгеновской кристаллографии для определения структуры

Метод дифракции рентгеновских лучей на монокристалле был предложен и разработан в 1912 году, и он стал наиболее важным и полезным инструментом для определения структуры белка, поскольку структура белка миоглобина была впервые определена в 1958 году.В настоящее время в банке данных белков (https://www.rcsb.org/) депонировано более 140000 белковых структур, почти 90% из которых разрешены с помощью метода рентгеновской дифракции на монокристаллах, что свидетельствует о его преимуществах при изучении структуры биологические кристаллы макромолекул.

Процесс дифракции рентгеновских лучей на монокристалле можно условно разделить на четыре этапа. Первым шагом является получение высококачественных монокристаллов целевого белка, что называется кристаллизацией белка.Когда раствор солюбилизированного белка достигает перенасыщения, он способствует агрегации и нуклеации белка. В конечном итоге отдельные белковые молекулы образуют повторяющуюся серию элементарных ячеек, принимая единую ориентацию. Квалифицированные кристаллы должны быть достаточного размера (обычно более 50 мкм по всем измерениям) и качества (правильная структура, без трещин или двойников). Получение монокристаллов высокого качества является ограничивающим шагом для определения структуры с помощью этого метода.

После получения монокристалла требуется дифракционный эксперимент.Кристалл иммобилизуют в интенсивном рентгеновском луче, создавая дифракционную картину, которая регистрируется как данные дифракции (угол и интенсивность дифрагированных рентгеновских лучей). По мере того, как кристалл постепенно вращается, предыдущие отражения исчезают и появляются новые. Интенсивность дифракции в каждом пятне регистрируется с каждого направления кристалла.

Впоследствии дифракционные данные, полученные из дифракционной картины, комбинируются с различными методами структурного анализа и подбора данных для анализа распределения электронной плотности в трехмерном пространстве внутри элементарной ячейки.

На последнем этапе на основе карты электронной плотности может быть создана и уточнена модель расположения атомов в кристалле.

Рис 3. Процесс дифракции рентгеновских лучей на монокристаллах

Этот метод может обеспечить высокое атомное разрешение и не ограничен молекулярной массой образца. Он подходит для водорастворимых белков, мембранных белков, а также для макромолекулярных комплексов. При правильном манипулировании он становится мощным инструментом для доставки надежных структурных данных биологических макромолекул и определения положения и структуры активного центра, а также помогает понять, как белок распознает и связывает молекулы лиганда на атомном уровне.

Однако метод дифракции рентгеновских лучей на монокристаллах также имеет ряд недостатков. Во-первых, образец должен быть кристаллизованным, но кристаллизация биологических макромолекул с большой молекулярной массой может быть затруднена, в частности, мембранные белки более сложно кристаллизовать из-за их большого размера и плохой солюбилизации. Во-вторых, должен быть получен организованный монокристалл, обеспечивающий соответствующую дифракцию. Наконец, полученная трехмерная структура биологического образца представляет собой только статическую форму исследуемой молекулы (одна из многих возможностей), а не динамическая.

2. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР)

Второй метод — ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Ядра — это заряженные, быстро вращающиеся частицы, похожие на внешние электроны. Гиромагнитные отношения разных ядер атомов различны и поэтому имеют разные резонансные частоты. Движение ядра не изолировано — оно взаимодействует с окружающими атомами как внутри-, так и межмолекулярно. Следовательно, с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса можно получить структурную информацию о данной молекуле.Взяв в качестве примера белок, его вторичная структура, такая как α-спираль, β-лист, поворот, круг и завиток, отражают различное расположение атомов основной цепи молекул белка в трехмерном пространстве. Расстояние между атомными ядрами в различных вторичных доменах, взаимодействие между ядрами и динамические характеристики полипептидных сегментов — все это напрямую отражает трехмерную структуру белков. Все эти ядерные особенности вносят вклад в спектроскопическое поведение анализируемого образца, обеспечивая, таким образом, характерные сигналы ЯМР.Интерпретация этих сигналов компьютерными методами приводит к расшифровке трехмерной структуры.

Рис.4. Ядерный спин

С момента первого наблюдения сигналов ЯМР в конденсированном состоянии в 1946 году технология ЯМР бурно развивалась на протяжении более 70 лет, и ее применение распространилось из области физики, такой как определение магнитного момента ядра, на химию, медицину, материаловедение, науки о жизни и многие другие.Примечательно, что в 1980-х годах технология ЯМР была творчески применена в структурном анализе белка, что способствовало применению ЯМР в биологической области. Хотя объем данных о трехмерной структуре белков, полученных с помощью технологии ЯМР, несопоставим с данными по дифракции рентгеновских лучей на монокристаллах, уникальные преимущества технологии ЯМР широко заметны: ЯМР может предоставить информацию на кинетической основе, таким образом, внутреннее перемещение белков в различных временных масштабах и их механизм связывания с лигандами могут быть решены.

ЯМР-эксперимент состоит из четырех основных этапов: подготовка образца, сбор данных, спектральная обработка и структурный анализ. ЯМР-анализ проводится на водных образцах белка с высокой чистотой, высокой стабильностью и высокой концентрацией. Объем образца от 300 до 600 мкл с диапазоном концентраций 0,1-3 мМ. Использование стабильных изотопов 15N, 13C и 2H для мечения белков может эффективно увеличить интенсивность сигнала и разрешение. Селективное мечение определенных аминокислот или химических групп белков может значительно уменьшить перекрытие сигналов.Для получения информации о белке используются многомерные ЯМР-эксперименты. Затем выполняется спектральная обработка для определения атомов белка, соответствующих каждому спектральному пику на разных спектрах ЯМР. Наконец, ряд пространственно структурированной информации, такой как константы связи NOE и J, используется для расчета пространственной структуры с использованием методов дистанционной геометрической или молекулярной динамики.

Рис.5. Процесс технологии ядерного магнитного резонанса

Наиболее важной особенностью метода ЯМР является то, что трехмерную структуру макромолекул в естественном состоянии можно измерить непосредственно в растворе, а ЯМР может предоставить уникальную информацию о динамике и межмолекулярных взаимодействиях.Разрешение макромолекулярной трехмерной структуры может достигать субнанометра.

Однако спектр ЯМР биомолекул с большой молекулярной массой очень сложен и труден для интерпретации, что ограничивает применение ЯМР при анализе больших биомолекул. Кроме того, этот метод требует относительно большого количества чистых образцов (порядка нескольких мг) для достижения приемлемого уровня отношения сигнал / шум.

3.Криоэлектронная микроскопия (Cryo-EM)

Третий подход — это метод криоэлектронной микроскопии (Cryo-EM), который включает три различных метода: анализ отдельных частиц, электронную томографию и электронную кристаллографию. Существенный механизм Cryo-EM — рассеяние электронов. Основной принцип описывается следующим образом. Образцы готовятся путем криоконсервации перед анализом. Когерентные электроны используются в качестве источника света для измерения образца. После того, как электронный луч проходит через образец и ближайший слой льда, система линз преобразует рассеянный сигнал в увеличенное изображение, записанное на детекторе.И обработка сигнала выполняется для получения трехмерной структуры образца.

Электронная микроскопия технология трехмерной реконструкции была впервые открыта в 1968 году. Трехмерная структура хвоста фага Т4 была реконструирована с помощью электронных микрофотографий. А затем были предложены общая концепция и методы трехмерной реконструкции электронной микроскопии. Для уменьшения радиационных повреждений в 1974 году была создана криогенная электронная микроскопия.После более чем 30 лет разработки Крио-ЭМ превратилась в мощный инструмент для изучения структуры биологических макромолекул. В последние годы технология Cryo-EM достигла революционного прогресса, особенно в анализе отдельных частиц. С 2013 года, благодаря огромным достижениям в области детектирования электронов и обработки изображений, крио-ЭМ-анализ одиночных частиц развивался настолько быстро, что разрешение Cryo-EM теперь сравнимо с разрешением рентгеновской дифракции на монокристаллах. В настоящее время Крио-ЭМ становится мощным инструментом для определения структуры биологических макромолекул с высоким разрешением.

Перед использованием Cryo-EM для наблюдения за образцом можно использовать отрицательное окрашивание EM для быстрого скрининга гомогенного образца. Метод анализа одиночных частиц Cryo-EM начинается со стеклования образца. Во время этого процесса раствор белка мгновенно охлаждается, поэтому молекулы воды не кристаллизуются, образуя аморфное твердое вещество. Затем замороженный образец проверяется, и данные собираются в системе. В течение этого периода можно сделать серию двумерных изображений. Затем на основе большого количества полученных двумерных изображений выполняется выравнивание и классификация частиц. В конце концов, данные обрабатываются программным обеспечением реконструкции для создания трехмерной структурной модели.

Рис.6. Процесс анализа одиночных частиц Cryo-EM

По сравнению с дифракцией рентгеновских лучей на монокристалле, обработка образца быстрым замораживанием сохраняет его состояние, близкое к естественному. Более того, этот метод требует лишь небольшого количества образца (около 0.1 мг), более проста в отношении чистоты образца и не требует кристаллизации белка.

Главный недостаток этого метода заключается в том, что частицы обнаруживаются в неизвестной ориентации. Высокий уровень шума из-за использования ограниченных доз электронов для минимизации радиационного повреждения, особенно при высоком разрешении, имеет тенденцию усложнять определение этих ориентаций, и это особенно важно для более мелких частиц. Следовательно, определение структуры биологических макромолекул с помощью Cryo-EM в последние несколько лет ограничивалось большими комплексами или моделями с низким разрешением.

Рис.7. Крио-электронная микроскопия

4. Резюме

Таким образом, каждая технология имеет свои преимущества в определенных приложениях, так что в одних случаях один метод может использоваться широко, а в других — редко. Таким образом, понимание характера анализа является ключевым при выборе метода. Неправильный выбор метода не только приведет к скомпрометированным результатам, он также может вызвать значительные задержки проекта и привести к финансовым потерям.Для получения дополнительной информации см. Таблицу 1.

	Преимущества	Недостатки	Объектов	Разрешение
Рентгеновская кристаллография	• Хорошо развито • Высокое разрешение • Широкий диапазон молекулярной массы • Легко для построения модели	• Трудно для кристаллизации • Трудный для дифракции • Предпочтительна цельная конструкция • Статическая структура кристаллического состояния	• Кристаллизующиеся образцы • Растворимые белки, мембранные белки, рибосомы, ДНК / РНК и белковые комплексы	Высоко
ЯМР	• Высокое разрешение • 3D структура в решении • Подходит для динамического обучения	• Необходимость высокой чистоты пробы • Сложен для пробоподготовки • Сложен для компьютерного моделирования	• МВт ниже 40–50 кДа • Водорастворимые образцы	Высоко
Крио-ЭМ	• Простая пробоподготовка • Состав в родном состоянии • Небольшой размер выборки	• Относительно низкое разрешение • Применимо только к образцам с высокой молекулярной массой • Сильно зависит от методов ЭМ • Дорогостоящее электромагнитное оборудование	•> 150 кДа • Вирионы, мембранные белки, большие белки, рибосомы, комплексные соединения	Относительно низкий (<3. 5 Å)

Таблица 1 Сравнение рентгеновской кристаллографии, ЯМР и крио-ЭМ

Список литературы

1. Wang, H.W .; Ван, В. Как криоэлектронная микроскопия и рентгеновская кристаллография дополняют друг друга. Protein Science 2017, 26 (1): 32-39.
2. Ранкин, Н .; и др. . Появление метаболомики протонного ядерного магнитного резонанса в сердечно-сосудистой системе с клинической точки зрения. Атеросклероз 2014, 237 (1): 287-300.
3. Каррони М., Сайбил Р. Криоэлектронная микроскопия для определения структуры макромолекулярных комплексов. Методы 2016, 95: 78-85.
4. Каллавей, Э. Революция не будет кристаллизоваться: новый метод пронизывает структурную биологию. Новости природы 2015 525 (7568): 172.

Обычно используемые флуорофоры FRET способствуют коллапсу белка, неупорядоченного в противном случае (Журнальная статья)

Рибак, Джошуа А. , Bowman, Micayla A., Zmyslowski, Adam M., Plaxco, Kevin W., Clark, Patricia L. и Sosnick, Tobin R. Обычно используемые флуорофоры FRET способствуют коллапсу неупорядоченного белка . США: Н. п., 2019. Интернет. DOI: 10.1073 / pnas.1813038116.

Рибак, Джошуа А., Боуман, Микайла А., Змысловски, Адам М., Плакско, Кевин В., Кларк, Патриция Л., & Sosnick, Tobin R. Обычно используемые флуорофоры FRET способствуют коллапсу неупорядоченного белка . Соединенные Штаты. https://doi.org/10.1073/pnas.1813038116

Рибак, Джошуа А., Боуман, Микайла А., Змысловски, Адам М., Плакско, Кевин В., Кларк, Патриция Л. и Сосник, Тобин Р. Вт. «Обычно используемые флуорофоры FRET способствуют коллапсу протеина с нарушенной структурой».Соединенные Штаты. https://doi.org/10.1073/pnas.1813038116. https://www.osti.gov/servlets/purl/1513009.

@article {osti_1513009,
title = {Обычно используемые флуорофоры FRET способствуют коллапсу протеина с нарушенной структурой},
автор = {Рибак, Джошуа А. и Боуман, Микайла А. и Змысловски, Адам М. и Плакско, Кевин В. и Кларк, Патриция Л.and Sosnick, Tobin R.},
abstractNote = {Размеры, которые развернутые белки, включая внутренне неупорядоченные белки (IDP), принимают в отсутствие денатуранта, остаются спорными. Мы разработали процедуру анализа профилей малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) и использовали ее, чтобы продемонстрировать, что даже относительно гидрофобные IDP остаются почти такими же расширенными в воде, как и при высоких концентрациях денатуранта. Напротив, как показано здесь, большинство измерений резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) показали, что относительно гидрофобные IDP значительно сокращаются в отсутствие денатурирующего агента. Здесь мы используем два независимых подхода для дальнейшего изучения этого противоречия. Во-первых, с помощью SAXS мы показываем, что флуорофоры, используемые в FRET, могут способствовать наблюдаемому несоответствию. В частности, мы обнаружили, что добавление Alexa-488 к нормально расширенному IDP вызывает сокращение еще на 15%, значение, которое разумно согласуется с сокращением, о котором сообщалось в исследованиях на основе FRET. Во-вторых, используя нашу процедуру моделирования и анализа для точного извлечения радиуса инерции (Rg) и расстояния от конца до конца (Ree) из профилей SAXS, мы проверили недавнее предположение, что результаты FRET и SAXS могут быть согласованы, если Rg и Ри «не связаны» (т.е., больше не просто пропорциональны), в отличие от случая гомополимеров случайного блуждания. Однако мы обнаружили, что даже для развернутых белков эти две меры измерений развернутого состояния остаются пропорциональными. Вместе эти результаты предполагают, что улучшенные процедуры анализа и коррекция значительных взаимодействий, управляемых флуорофором, достаточны для согласования предыдущих исследований SAXS и FRET, обеспечивая тем самым единую картину природы развернутых полипептидных цепей в отсутствие денатурирующего агента. },
doi = {10.1073 / pnas.1813038116},
url = {https://www.osti.gov/biblio/1513009}, journal = {Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America},
issn = {0027-8424},
число = 18,
объем = 116,
place = {United States},
год = {2019},
месяц = ​​{4}
}

Флуоресцентная микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET) — Общие понятия

Вводные понятия

Точное расположение и природа взаимодействий между конкретными молекулярными видами в живых клетках представляет большой интерес во многих областях биологических исследований, но исследованиям часто мешает ограниченное разрешение инструментов, используемых для изучения этих явлений.Обычная широкопольная флуоресцентная микроскопия позволяет локализовать флуоресцентно меченые молекулы в пределах оптического пространственного разрешения, определенного критерием Рэлея, примерно 200 нанометров (0,2 микрометра). Однако для понимания физических взаимодействий между белками-партнерами, участвующими в типичном биомолекулярном процессе, относительная близость молекул должна быть определена более точно, чем позволяют традиционные методы оптической визуализации с дифракционным ограничением. Метод резонансной передачи энергии флуоресценции (чаще обозначаемый аббревиатурой FRET ) в применении к оптической микроскопии позволяет определять сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров (см. Рисунок 1), расстояние, достаточно близкое для происходить молекулярные взаимодействия.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на большей длине волны. Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани. При использовании этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими, и эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.Флуоресцентный резонансный перенос энергии — это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора возбужденного состояния ко второму хромофору в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен приблизительно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения резонансной передачи энергии могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий. .

Механизм резонансной передачи энергии флуоресценции включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему акцептору хромофору без излучения за счет диполь-дипольных взаимодействий на большие расстояния. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться энергетическому обмену со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту.В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся с той же частотой. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта. В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансная передача энергии нечувствительна к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая обнаруживается с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем краткосрочные эффекты растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление резонансной передачи энергии флуоресценции не опосредовано испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение передачи энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии акцепторной флуоресценции. Эффективность процесса передачи энергии изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора.Следовательно, измерения FRET могут использоваться как эффективная молекулярная линейка для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорохромом, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга.

Гипотетический пример резонансного переноса энергии флуоресценции между двумя флуорохромами, прикрепленными к противоположным концам одного и того же макромолекулярного белка, представлен на рисунке 1. В нативной конформации (рисунок 1 (a)) два флуорофоров разделены расстоянием приблизительно 12 нанометров, слишком далеко для передачи энергии внутримолекулярного резонанса между флуорохромами. Однако, когда белок подвергается конформационному изменению (рис. 1 (b)), два флуорохрома сближаются гораздо ближе и теперь могут участвовать в молекулярных взаимодействиях FRET. На рисунке возбуждение донорного флуорохрома обозначается синим свечением вокруг желтой трехъядерной ароматической молекулы, в то время как соответствующая акцепторная эмиссия (рисунок 1 (b)) представлена ​​зеленым свечением, окружающим второй гетероциклический флуорохром справа. -ручная сторона белка.Измерения передачи энергии часто используются для оценки расстояний между сайтами макромолекулы и влияния конформационных изменений на эти расстояния. В этом типе экспериментов степень передачи энергии используется для расчета расстояния между донором и акцептором и получения структурной информации о макромолекуле.

Хотя флуоресцентный резонансный перенос энергии часто использовался для исследования межмолекулярных и внутримолекулярных структурных и функциональных модификаций белков и липидов, основным препятствием для реализации методов FRET-микроскопии в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белки с соответствующими флуорофорами. Клонирование зеленого флуоресцентного белка медузы ( GFP ) и его экспрессия в широком спектре типов клеток стали критическим ключом к разработке маркеров как для экспрессии генов, так и для структурной локализации белка в живых клетках. Было разработано несколько вариантов мутаций этого белка, различающихся по спектру, включая флуоресцентный белок, излучающий синий свет ( синий флуоресцентный белок , BFP ). Спектры возбуждения и излучения для нативных мутантов GFP и BFP достаточно разделены по длинам волн, чтобы быть совместимыми с подходом FRET.Рисунок 2 иллюстрирует стратегию обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и мутантных флуоресцентных белков. Если два белка, один из которых помечен BFP (донор), а другой — GFP (акцептор), физически взаимодействуют, то при возбуждении комплекса при максимальной длине волны поглощения будет наблюдаться повышенная интенсивность на максимуме эмиссии акцептора (510 нанометров). (380 нм) донора. Неспособность белков образовать комплекс не приводит к эмиссии акцепторной флуоресценции (GFP).

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, оптики микроскопов и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках. В дополнение к исследованию взаимодействий белковых партнеров, недавние применения флуоресцентного резонансного переноса энергии включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы передачи энергии резонанса флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может иметь место, когда донорный флуорофор в электронно возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения соседнему хромофору, акцептору. В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывает спектр поглощения молекулы-акцептора, и они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через диполь-дипольные межмолекулярные соединения на большие расстояния. связь.Теория, предложенная Теодором Фёрстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Фёрстер также разработал формальное уравнение, определяющее связь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами задействованных хромофоров.

Резонансная передача энергии — это безызлучательный квантово-механический процесс, который не требует столкновения и не требует выделения тепла. Когда происходит передача энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается повышенное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. Рисунок 3).Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и детектируя свет, излучаемый с длинами волн с центром вблизи максимума излучения акцептора. Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рисунке 3 представлена ​​диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между испусканием донора и поглощением акцептора в резонансной передаче энергии флуоресценции.Абсорбционные и эмиссионные переходы изображены прямыми вертикальными стрелками (зелеными и красными соответственно), а колебательная релаксация — волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы нарисованы пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3).Результирующее излучение сенсибилизированной флуоресценции имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Чтобы произошла резонансная передача энергии, необходимо выполнить несколько критериев. В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения донорных и акцепторных молекул, два задействованных флуорофора должны располагаться на расстоянии от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Фёрстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между молекулами донора и акцептора уменьшается в шестой степени расстояния, разделяющего их.Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор примерно 10 нанометрами. На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов передачи энергии и / или электронов. Зависимость резонансного процесса передачи энергии от расстояния является основной основой его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий.В исследованиях живых клеток с участием молекул, меченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансная передача энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансного переноса энергии является то, что время жизни флуоресценции донорной молекулы должно быть достаточным для того, чтобы событие могло произойти. Как скорость ( K (T) ), так и эффективность ( E (T) ) передачи энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.Согласно теории Фёрстера, подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

KT = (1 / τD) • [R0 / r] 6

, где R (0) — критическое значение Фёрстера расстояние , τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора, а r — расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры. Критическое расстояние Фёрстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость передачи равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора.Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, тогда эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору за счет резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается за счет комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.

Концептуально критическое расстояние Фёрстера — это максимальная длина разделения между донорными и акцепторными молекулами, при которой все еще будет происходить резонансная передача энергии.Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц. Значение R (0) (в нанометрах) может быть вычислено из следующего выражения:

R0 = 2,11 × 10-2 • [

κ

2 • J (λ) • η-4 • QD] 1/6

, в котором κ -квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (λ) — интеграл перекрытия в области излучения донора. и спектры поглощения акцептора (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:

r = R0 • [(1 / ET) — 1] 1/6

и E (T) вычисляется как:

ET = 1 — (τDA / τD)

, где τ (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора. Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рис. 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость резонансной передачи энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве пара резонансного переноса энергии флуоресценции. Спектры поглощения обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры эмиссии представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Базовая теория безызлучательного переноса энергии непосредственно применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь зависит от κ -квадрат, J (λ) , η и Q (D) . Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлены серии экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает в себя выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неопределенности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от изменений J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Ферстера для обычных пар донор-акцептор RET

Донор	Акцептор	Расстояние Фёрстера (нанометры)
Триптофан	Дансил	2.1
ИАЭДАНЫ (1)	ДДПМ (2)	2,5 — 2,9
BFP	DsRFP	3,1 — 3,3
Дансил	FITC	3,3 — 4,1
Дансил	Октадецилродамин	4. 3
CFP	GFP	4.7 — 4,9
CF (3)	Техасский красный	5.1
Флуоресцеин	Тетраметилродамин	4,9 — 5,5
Cy3	Cy5	> 5,0
GFP	YFP	5,5 — 5,7
BODIPY FL (4)	BODIPY FL (4)	5.7
Родамин 6G	Малахитовый зеленый	6.1
FITC	Эозин тиосемикарбазид	6,1 — 6,4
B-фикоэритрин	Cy5	7.2
Cy5	Cy5.5	> 8,0

(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир
(4) 4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенность в оценке коэффициента ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Фёрстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная продолжала оставаться в силе. несколько спорным.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения κ в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора путем вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может варьироваться от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за связи корня шестой степени с расстоянием Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит только к 26-процентному изменению рассчитанного расстояния, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу, и соответствующее значение квадрата κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение о том, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции донора и акцептора могут позволить определить пределы для отклонения в квадрате κ . Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность в коэффициенте ориентации. Ограничение возможных значений κ -квадрат таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, если вообще возможно, определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансной передачи энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием резонансной спектроскопии переноса энергии и рентгеновской дифракции в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предлагается теорией Фёрстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Для более крупных белков существует большая неопределенность. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадрат требуют полной поляризации флуоресценции донора и акцептора, а это условие вряд ли будет достигнуто.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близким расположением донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность, обусловленную фактором ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( κ -квадрат) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) определяется уравнением:

κ

2 = (cos θT — 3cos θDcos θA) 2 = (sin θD sin θAcos Φ — 2cos θDcos θA) 2

, где θ (T) — угол между диполем перехода излучения донора и диполем перехода поглощения акцептор, θ (D) и θ (A), — это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донором и акцептором приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение критического расстояния Ферстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояние донор-акцептор близко к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни распада флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии с помощью механизма Ферстера является сложным в некоторых аспектах, но простым и надежным по своему результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансная передача энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекул донора-акцептора находится в непосредственной близости. Сложность в теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрических форм и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод изучения пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований флуорофоров, образца и режима (-ов) визуализации, но практически любой прямой или инвертированный микроскоп можно дооснастить для FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).Как правило, микроскоп должен быть оснащен охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), соединенной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимумом сквозного спектрального шума. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или устранить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что приводит к получению изображений со значительным расфокусированным сигналом, что снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET. Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, близкими к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар флуорофора донора и акцептора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, способная наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культуры тканей оснащен стандартной вольфрам-галогенной лампой на столбе для исследования и записи ячейки, использующие стандартное освещение светлого поля, фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста ( DIC ).Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста могут использоваться в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. Стандартная камера CCD с охлаждением Пельтье прикреплена к тринокулярной головке микроскопа для получения широкопольной флуоресценции и захвата изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с использованием мультиспектрального освещения с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы и переданных в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.С проиллюстрированной конфигурацией микроскопа совместимы различные программы обработки изображений.

Основываясь на фундаментальных принципах этого явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

• Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
• Фотообесцвечивание необходимо устранить, потому что артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
• Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
• Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок в измерениях FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
• Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
• Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
• Молекула-донор должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.
• Донор должен иметь низкую поляризационную анизотропию, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации (-квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, излучение которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
• При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результатов измерений резонансной передачи энергии.
• Поскольку резонансный перенос энергии флуоресценции требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы.Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть присоединены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что молекулы донора и акцептора расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
• Живые клетки, помеченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставляло значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образцов, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается сопутствующим уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора может рассматриваться как показатель резонансного переноса энергии, обычно используется отношение двух значений, I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объёме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между молекулярными парами, вызывает изменение соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскопе путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и детектирования повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным гашением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется установившимся режимом флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Подходящие донорные и акцепторные зонды выбираются на основании их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия эмиссии между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит эмиссия акцептора. На практике может быть сложно определить пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны в пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепи событий, могут быть помечены слиянием с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное снижение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение излучения донора (рис. 8 (а)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль излучения акцептора (рис. 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками

Среди факторов, которые могут потенциально повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, несколько очень специфичны. к оптическому микроскопу.Основная цель микроскопических исследований — получить изображения с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность. Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может повлиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные доказательства, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии сокращает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и, следовательно, наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны и влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой.В некоторых отношениях метод фотообесцвечивания доноров менее сложен, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения эмиссии донора измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод корректировки обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, а полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух существенных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах с резонансным переносом энергии флуоресценции. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра излучения акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал излучения донора (нежелательные длины волн) проходит через фильтр излучения. Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют собой коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленая) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентраций донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением, которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение затухания интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение для среднего времени жизни, при регистрации как интенсивность в установившемся состоянии, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривой затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной одноэкспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

I (t) = I0 exp (-t / τ )

, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основное общее преимущество FRET измерений с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом состоит в том, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью. Это происходит отчасти потому, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может изменяться множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресцентных ламп, классифицируются как во временной области ( импульсный , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции получается путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход в частотной области использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную от импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется из фазового сдвига и глубины демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной областей для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы обнаружения с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны к выполнению, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего света может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками. Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений срока службы от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований с помощью измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы на образец воздействовали либо высокочастотные повторяющиеся импульсы возбуждающего света, либо непрерывный свет с синусоидальной модуляцией. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенными применениями флуоресцентного резонансного переноса энергии являются измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами. Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки с помощью множества биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве флуорофора внутреннего донора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии в установившемся состоянии. измерения, как обсуждалось выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Несколько биологических приложений, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Хотя для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Тем не менее, несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне трудно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают повысить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э. Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Joseph R. Lakowicz — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers and Michael W.Дэвидсон — Национальная лаборатория сильного магнитного поля, 1800 Ист. Пол Дирак, доктор, Государственный университет Флориды, Таллахасси, Флорида, 32310.

Основные объекты — Хьюстонский университет

Управление исследовательских основных объектов работает с целью использования оборудования, ресурсов и высококвалифицированный персонал, доступный для широкой группы исследователей как внутри, так и за пределами UH. Хотя ядра существуют на уровне университета, колледжа и факультета, они поддерживают общий организационный зонтик в рамках отдела исследований. Офис также управляет исследовательскими зданиями и работает с колледжами для решения и удовлетворения потребностей исследовательской инфраструктуры.

• • Animal Behavior Core
    Services: UH ABC доступен для всех исследователей UH , которые хотели бы использовать оборудование ABC или запросить тестирование поведения на грызунах. Внешние клиенты могут запросить полный спектр услуг поведенческого тестирования, предлагаемых UH ABC.
    Помещения: площадь около 2000 футов ² , 11 отдельных комнат для тестирования, широкий выбор оборудования для поведенческого тестирования, все оценки доступны как для моделей мышей, так и для моделей крыс, новейшее программное обеспечение Noldus для сбора и анализа многочисленных поведенческих показателей.
  • Операции по уходу за животными
    Услуги: ACO предоставляет профессиональные ветеринарные, хирургические услуги и услуги по уходу за животными. Преподаватели, сотрудники и стажеры UH могут пройти обучение по уходу за животными и их использованию.
    Оборудование: автоклавы, вытяжки класса II, шкафы с чистым воздухом, стеллажи, рабочие станции и т. Д.
  • Центр исследований дизайна Бурдетт Киланд-младший
    Услуги: производственные помещения для студентов колледжа архитектуры и дизайна Хьюстонского университета с более чем 50 машинами.Оснащен новейшими инструментами для деревообработки, металлообработки и цифрового производства. Учащиеся, прошедшие курсы по технике безопасности и обучающие демонстрации, имеют удобный доступ к важным инструментам своей профессии, что дает им ценный опыт создания прототипов, изготовления и построения моделей во время соревнований по своей дисциплине.
  • Biology and Biochemistry Imaging Core
    Services: Предоставляет местному исследовательскому сообществу недорогой доступ к современным приборам для микроскопии и обучение их использованию.Направлен на то, чтобы помочь вам получить наилучшие данные из ваших экспериментов с помощью конфокальной микроскопии, изображений Ca2 +, FRAP, FRET и других передовых методов микроскопии.
    Оборудование: инвертированный конфокальный микроскоп Olympus FV1000; Вертикальный конфокальный микроскоп Leica SP8 в нашей основной комнате (SR2 328A). Стереоскоп Leica MZ8 для препарирования доступен для использования при пробоподготовке.
  • Основная лаборатория исследований в области биомедицинской инженерии
    Услуги: предоставление исследователям единого центра, где они могут получить доступ к различным инструментам для проведения своих исследований в области молекулярной и клеточной биологии, визуализации, биоматериалов и тканевой инженерии.
    Оборудование: BMERCL оборудован лабораторными скамьями, раковинами, безопасным душем и станцией для промывания глаз, вытяжкой для химикатов, системой обратного осмоса и очистки воды, автоклавом, складскими помещениями при 4 atC, -20˚C, -85˚C, и жидкостный азот, настольная охлаждаемая центрифуга и сверхскоростная центрифуга. BSL 2 для проведения исследований в области клеточной и тканевой инженерии; Комната для микроскопов оборудована двумя флуоресцентными микроскопами Olympus: перевернутым и вертикальным микроскопом; Установка для изготовления как залитых парафином, так и замороженных срезов тканей. В нем также находится автоматическая окраска предметных стекол; Multimode Plate Reader, два прибора Nanodrop (спектрофотометр UV / Vis и флуоресцентный спектрофотометр), спектрофотометр HP / Agilent UV / Vis с диодной матрицей и спектрофлуориметр NanoLog; Оборудован количественным термоциклером в реальном времени и сканером микрочипов; Содержит систему документации геля.
  • Центр передовых вычислений и систем данных
  • Центр технологий наук о жизни
    Услуги: Занимается разработкой инновационного междисциплинарного образования на основе исследований, развитием трудовых ресурсов 21 века, информационно-просветительской деятельностью и передовыми исследованиями.
    Оборудование: биоферментеры; Хроматографические системы; Секвенирование amd PCR; Считыватель планшетов и спектрофотометр; Центрифугирование и др.
  • Центр ядерных рецепторов и клеточной сигнализации
  • Центр нефтяной геохимии
    Услуги: отраслевые исследования и разработки; Специализированная техническая поддержка; Многопрофильные специалисты
    Оборудование: союзные геофизические лаборатории; Лаборатория Карбонатных Исследований; Геохимия: ICP AES, Лаборатория гидрогеохимии ICP-MS; Полевое оборудование для гидрогеологии; Лаборатория MC-ICP-MS; Лаборатория палеомагнетики; Лаборатория масс-спектрометров, геохимии элементов платиновой группы и термической ионизации; Лаборатория стабильных изотопов; Лаборатория термохронологии; Рентгеновская кристаллография; И Т. Д.
  • Сервисный центр механического цеха CHBE
    Услуги: Станки и изготовление
    Оборудование: Фрезерный станок с ЧПУ HAAS; Токарный станок с ЧПУ Colcheseter 600; Фрезерный станок MSC; Сверлильный станок; Мостовой порт Мельница; Токарный станок LeBlond; Ленточная пила; Ножницы по металлу, настольные ножницы; Настольные ножницы по металлу; Горизонтальная запрещенная пила Wilton; Миллер TIG Welder; Разное. Шлифовальные машины; пр.
  • Химическое оборудование (электроника, стекло, оборудование, ЯМР, рентген)
    • Услуги ЯМР: Предоставляет университетскому исследовательскому сообществу недорогой доступ к трем высокопольным ЯМР-спектрометрам, доступным круглосуточно.По мере необходимости предоставляется базовая оперативная подготовка к продвинутому экспериментальному обучению. Внешние клиенты могут запросить аналитические услуги ЯМР, которые, по возможности, включены в требования к расписанию исследований Университета.
      • Приборы: JEOL ECZ400 с двойным широкополосным 5-миллиметровым зондом H / F — X, JEOL ECA500 с двойным широкополосным 5-миллиметровым зондом H / F — X и твердотельным зондом 3,2 мм {H} X CPMAS, JEOL ECA600II с H / F — X двойной широкополосный зонд 5 мм. Лицензионная программа обработки JEOL Delta 5.3 доступны по запросу.
    • Стеклодувные услуги: Научные услуги по выдуванию стекла; изготовление посуды на заказ. Предоставляет услуги научной механической обработки; изготавливать аппаратуру и детали из различных материалов по индивидуальным техническим требованиям; также обеспечиваем ремонтные работы и помогаем с дизайном.
    • Услуги рентгеновской дифрактометрии: кристаллографический анализ монокристаллов; Рентгеновская порошковая дифракция.
      
      • Оборудование: порошковый рентгеновский дифрактометр; Рентгеновский дифрактометр CCD.Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия
  • Центр инженерной микроскопии Коллена Каллена (требуются документы)
    Услуги: Сканирующая электронная микроскопия.
    Оборудование: Leo 1525 Сканирующий электронный микроскоп.

Конформационная гетерогенность савиназы по данным ЯМР, HDX-MS и рентгеноструктурного анализа [PeerJ]

Введение

Субтилизины представляют собой сериновые протеазы с широкой субстратной специфичностью, которые нашли широкое применение в индустрии стиральных порошков. Субтилизин из 269 аминокислот из Bacillus lentus (савиназа) и гомологичные субтилизины из B. alcalophilus, B. amyloliquefaciens и B. subtilis являются наиболее изученными белками этого класса (Betzel et al., 1992; Remerowski et al., 1994; Martin et al., 1997; Graycar et al., 1999; Mulder et al., 1999; Radisky & Koshland, 2002; Tindbaek et al., 2004; Jones, 2011). Субтилизины составляют структурное семейство с α / β складкой и мономерной почти сферической структурой.Каталитическая триада Asp / Ser / His расположена в бороздке на поверхности белка. Подложка связывается в двух больших карманах канавки, таким образом располагая ножничную связь в активном центре. Субстратная специфичность низкая, но предпочтение отдается гидрофобным остаткам в положениях P1 и P4 субстрата (Schechter & Berger, 1967). В структуре савиназы два структурных сайта связывания металлов заняты Na ⁺ и Ca ²⁺ (Frankaer et al., 2014).

Анализ быстрой динамики белков с помощью ЯМР-спектроскопии ранее продемонстрировал, что структура в целом очень жесткая, но что пептидный сегмент 125–128, который участвует в связывании субстрата, является динамичным как во временном масштабе быстрее, чем наносекунды, так и в отношении временная шкала в миллисекундах (Ремеровски и др. , 1996). В том же исследовании повышенная динамика наблюдалась также для остатков 103 и 104, которые покрывают ту же часть сайта связывания субстрата, что и сегмент 125–128, и которые, как полагают, важны для контроля доступа субстрата к сайту связывания. Эти наблюдения были подтверждены измерениями релаксации ЯМР и водородного обмена гомологичного субтилизина PB92 (Martin et al., 1997; Mulder et al., 1999).

Благодаря повышенной чувствительности и разрешающей способности методов, используемых для оценки динамики белков, появилось несколько примеров, в которых конформационные изменения были связаны с конкретными этапами молекулярного механизма функции белка.Методы релаксации ЯМР использовались для характеристики конформационных изменений во время катализа, например, в дигидрофолатредуктазе (DHFR) (Boehr et al., 2010), циклофилине A (Eisenmesser, 2002), аденилаткиназе (Wolf-Watz, Kay & Kern, 2005 ) и триггерный фактор (Saio et al., 2018). Следуя температурной зависимости химических сдвигов, ЯМР также можно использовать для исследования существования альтернативных состояний (Williamson, 2003; Teilum, Poulsen & Akke, 2006; Doyle et al. , 2016). И релаксация, и температурная зависимость химических сдвигов чувствительны к состояниям, заселенным всего на 1% (Williamson, 2003; Kay, 2016).Развитие методов анализа электронной плотности вблизи уровня шума дало глубокое понимание альтернативных конформационных состояний белков и конформационных изменений, происходящих во время ферментативного обмена (Fraser et al., 2009; Fraser et al., 2011). Последние достижения в области жидкостных хроматографических систем, чувствительности масс-спектрометров и инструментов анализа данных МС сделали HDX-MS чувствительным и мощным инструментом для изучения конформационной динамики белков (Engen, 2009; Jensen & Rand, 2016; Masson et al., 2019). Эти достижения возродили использование водородного обмена для оценки локальной конформационной динамики с минимальными количествами белков в растворе (Fast, Vahidi & Konermann, 2017; Trabjerg, Nazari & Rand, 2018), а также в мембранах (Möller et al., 2019; Nielsen et al., 2019). Несмотря на глубокое понимание механизма многих ферментов, существование обнаруживаемой конформационной динамики, важной для каталитического механизма, не универсально (Jensen, Winther & Teilum, 2011).

Здесь мы задались вопросом, представляет ли конформационная динамика, ранее наблюдаемая в Savinase с помощью ЯМР-спектроскопии, существование определенного конформационного состояния, которое потенциально может быть связано с функцией фермента. Чтобы исследовать конформационную гетерогенность, мы проследили температурно-зависимые изменения химического сдвига, измерили изменения локальной стабильности фермента при связывании ингибитора и, наконец, проанализировали разницу в электронной плотности на основе рентгеновских данных, собранных как при криогенных температурах, так и при температуре окружающей среды. .Наш анализ показывает, что савиназа в целом имеет очень небольшую конформационную динамику, за исключением петель связывания субстрата, контролирующих доступ к активному сайту, которые более подвижны, чем остальная часть молекулы.

Материалы и методы

Производство белка

Коммерчески доступную савиназу (Novozymes A / S) растворяли в 0,1 М диметилглутаровой кислоте, pH 6,5, 0,2 М борате, 2 мМ CaCl ₂ и прогоняли через колонку Sephadex G25 SEC, уравновешенную тем же буфером. Образец очищали ионообменной хроматографией на CM-сефарозе с градиентом от 0 до 100 мМ NaCl в указанном выше буфере, как описано ранее (Betzel et al., 1988). Фракции пиков были объединены, и для хранения буфер был заменен на 100 мМ H ₃ BO ₃ , 10 мМ 2- (N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES), 2 мМ CaCl ₂ и 200 мМ NaCl при pH 6 путем ультрафильтрации. Среда для экспрессии образцов, меченных ¹⁵ N (и ¹³ C), была заменена на M9 с NH ₄ Cl в качестве единственного источника азота (и U- ¹³ C ₆ глюкоза в качестве единственного источника углерода. ).

Подготовка проб ЯМР

Для ЯМР 10 мкМ савиназы инкубировали с 10 мМ PMSF в 20 мМ Na ₂ HPO ₄ -цитрат, pH 7. Смесь инкубировали при 4 ° C в течение приблизительно 4 часов и затем фильтровали через фильтр 0,2 мкм. . Савиназа, ингибированная PMSF, была отделена от непрореагировавшего PMSF, сконцентрирована до 0,8 мМ и буфер был заменен на 10 мМ Na ₂ HPO ₄ / NaH ₂ PO ₄ , 2 мМ CaCl ₂ , 1 ​​мМ 4 , 4-диметил-4-силапентан-1-сульфоновая кислота (DSS), 10% D ₂ O, pH 7.

ЯМР эксперименты

Все спектры были записаны на спектрометре Varian Inova 750 МГц, данные были обработаны с помощью NMRPipe (Delaglio et al., 1995) и проанализированы с использованием CCPNMR (Skinner et al., 2016). Каркасные резонансы для PMSF-савиназы были отнесены к спектрам ¹ H- ¹⁵ N HSQC, HNCA, HNCACB, записанным со ссылкой на опубликованные отнесения савиназы (Remerowski et al., 1994; Remerowski et al., 1996; Martin et al., 1997).

Эксперимент по температурному титрованию был выполнен для PMSF-Savinase на спектрометре Varian Inova 750 МГц. Одномерные спектры ¹ H с предварительным насыщением и спектры ¹ H, ¹⁵ N HSQC были записаны с интервалом 2 К от 289 К до 307 К. Химические сдвиги протонов амида основной цепи при каждой температуре были измерены с точностью 0,001 ppm относительно DSS. Полиномиальные модели первого и второго порядка были приспособлены к химическим сдвигам ¹ H ^N в зависимости от температуры. Тест F ( p <0,05) применяли для определения значительных отклонений от линейности.

HDX-MS пробоподготовка

Образцы савиназы, ингибированной ФМСФ, и немеченой изотопом савиназы получали, как описано выше. Образцы неингибированной и немеченой изотопом савиназы получали путем замены буфера на 300 мМ Na ₂ HPO ₄ / NaH ₂ PO ₄ , pH 7 для удаления ингибитора бората. Чтобы начать реакцию HDX, 50 мкМ савиназы смешивали 1:20 с буфером для мечения HDX (20 мМ Bis-Tris, 10 мМ CaCl ₂ в 99.9% D ₂ O, pD = 7,0) при 25 ° C. Через интервалы времени 0,25 мин, 1 мин, 10 мин и 60 мин реакцию обмена гасили переносом 50 мкл исходной реакционной смеси в 50 мкл буфера гашения HDX (300 мМ KH ₂ PO ₄ / H ₃ PO ₄ , pH = 2,3) при 0 ° C. Дейтерированные образцы немедленно замораживали и хранили при -80 ° C до проведения анализа ЖХ-МС.

Полностью дейтерированные образцы савиназы получали инкубацией в 8 М дейтерированном GndHCl (95% D ₂ O) в течение ночи, и реакцию гасили в тех же условиях, что и выше. Для получения недейтерированных эталонов 50 мкМ савиназы смешивали с буфером HDX, приготовленным в H ₂ O, в объемном соотношении 1:24. Раствор разбавляли таким же объемом гасящего буфера HDX, чтобы получить окончательный образец. Полностью дейтерированные и недейтерированные образцы хранили при -80 ° C до анализа.

Глобальные эксперименты HDX-MS

Анализ

Global HDX-MS проводили на комбинированной системе HDX-UPLC с масс-спектрометром Synapt G2 (Waters).Температуру системы UPLC поддерживали на уровне 0 ° C и снабжали колонкой-ловушкой C4 (колонка ACQUITY UPLC BEH C4 1,7 мкм VanGuard, Waters) и аналитической колонкой C4 (колонка ACQUITY UPLC BEH C4 1,7 мкм, Waters). Образец белка сначала обессоливали на колонке-ловушке со скоростью потока 200 мкл / мин подвижной фазы A (0,23% муравьиной кислоты в H ₂ O) в течение 3 минут для удаления буферных добавок, которые могут препятствовать ионизации. Белок элюировали 7-минутным градиентом от 8% до 40% подвижной фазы B (0.23% муравьиной кислоты в ацетонитриле) для ESI-MS со скоростью 40 мкл / мин. Генерированные положительные ионы анализировались масс-спектрометром в режиме MS-only с диапазоном сканирования от 50 до 2000 m / z за 1 с. Глобальные эксперименты HDX проводились в двух экземплярах.

Локальные эксперименты HDX-MS

Локальный HDX-MS анализ выполняли на комбинированной системе HDX-UPLC с масс-спектрометром Synapt G2 (Waters). Температура устройства HDX-UPLC поддерживалась на уровне 0 ° C, и система была оборудована колоночной ловушкой C18 (ACQUITY UPLC BEH C18 1.Колонка VanGuard 7 мкм) и аналитическая колонка C18 (колонка ACQUITY UPLC BEH C18 1,7 мкм). Дейтерированные и недейтерированные белки расщепляли в оперативном режиме при 20 ° C, когда они проходили через вручную заполненную колонку с пепсином (пепсиновая агароза, Pierce). Полученные пептиды обессоливали на колонке-ловушке со скоростью потока 200 мкл / мин подвижной фазы A. Пептиды элюировали с 12-минутным градиентом от 8% до 40% подвижной фазы B на масс-спектрометр для положительного режима ESI при скорость 40 мкл / мин. Для картирования пептидов масс-спектрометр работал в режиме MSe (DIA) с CID-фрагментацией.Диапазон сканирования был установлен на 300–2000 m / z для MS и 50–2000 m / z для MS / MS, при времени сканирования 0,5 с. Для дейтерированных образцов масс-спектрометр работал в режиме МС с диапазоном сканирования 50–2000 m / z и временем сканирования 0,3 с. Локальные эксперименты HDX были выполнены в трех повторностях.

Анализ данных

Для анализа интактной массы (глобальный HDX-MS) полученные спектры были деконволюционированы с помощью MaxEnt в MassLynx 4.1 (Waters), и разрешение деконволюции было установлено на 0.1 Да. Для локального анализа HDX-MS пептиды были идентифицированы путем поиска в базе данных с использованием PLGS 2.5 (Waters). Анализ уровней пептидного дейтерия выполняли с использованием DynamX 3.0 (Waters). Окончательные обработанные данные HDX были экспортированы непосредственно из DynamX 3.0 в Pymol (Schrödinger) для иллюстрации. Нормализованная фракция поглощения дейтерия оценивается по: Нормализованный HDX% = mD − mNon_D ∕ mFull_D − mNon_D × 100%.

Где m _D , m _{Non_D} и m _{Full_D} — это центроидные массы дейтерированных пептидов в каждый момент времени, недейтерированных пептидов и полностью дейтерированных пептидов при текущих экспериментальных условиях, соответственно.Чтобы предоставить доступ к данным HDX этого исследования, сводная таблица данных HDX (таблица S1) и таблица данных HDX (таблица S2) включены в дополнительную информацию в соответствии с рекомендациями сообщества (Masson et al., 2019) .

Кристаллизационные и дифракционные эксперименты

Кристаллы как для комнатной температуры (RT), так и для криогенных наборов данных были отобраны из условия G2 экрана PACT (Newman et al., 2005), 0,2 М NaBr, 0,1 М бис-трис-пропан, pH 7.5, 20% ПЭГ3350. Данные дифракции рентгеновских лучей были собраны на канале связи I03 с алмазным источником света. Температура окружающей среды (данные RT) была собрана при 297 К и показала незначительные радиационные повреждения; криогенные данные (криоданные) были собраны при 100 К. Изображения были интегрированы с использованием XDS (Kabsch, 2010) и масштабированы с помощью Aimless (Evans & Murshudov, 2013).

Расчет и доработка первичной конструкции

Молекулярное замещение было выполнено с использованием опубликованного 1.Кристаллическая структура савиназы дикого типа с разрешением 4 Å (код доступа PDB: 4CFY) в качестве модели поиска (Frankaer et al., 2014). Уточнение было выполнено PHENIX (Liebschner et al., 2019), чтобы установить предварительные одноконформерные структуры для RT и криогенных кристаллов.

Генерация мультиконформного ансамбля с помощью qFit

Как для RT, так и для криогенных данных и, исходя из структур с одним конформером, был запущен qFit (Keedy, Fraser & Van den Bedem, 2015) для автоматического построения мультиконформерных моделей на основе наблюдаемой электронной плотности.После автоматического создания модели qFit в модели было внесено несколько ручных корректировок. Пять дополнительных циклов структурной оптимизации были выполнены с использованием Phenix.refine с уточнением занятости и автоматическим подбором растворителя. Атомы водорода не добавляли. Модели уточнялись с использованием анизотропных B-факторов, за исключением молекул воды.

Анализ Рингера для карт электронной плотности в рентгеновских лучах

Оптимизированные карты плотности 2mF _o -DF _c для моделей с одним конформером были рассчитаны с использованием Phenix.карты с шагом сетки 0,2 разрешения. Усредненную конформацию боковой цепи моделей с одним конформером для каждого остатка использовали в качестве входных данных для анализа Рингера (Fraser et al., 2009; Lang et al., 2010). Торсионные углы боковой цепи увеличивали с шагом 10 ° и сравнивали с электронной плотностью выше 1 σ для построения альтернативных конформаций боковой цепи. Полученные мультиконформерные модели с альтернативными конформациями боковых цепей были оптимизированы с помощью Phenix.refine с теми же настройками уточнения, что и для уточнения моделей qFit, описанных выше.Плотности электронов для остатков с альтернативными конформациями после анализов qFit и Рингера были проверены в COOT, и только те с убедительными доказательствами альтернативных конформаций были приняты для окончательных моделей.

Результаты

Широкая специфичность савиназы делает ее субстратом для себя. Чтобы приготовить образцы, которые достаточно долго стабильны для наших измерений ЯМР, необходимо было необратимо ингибировать фермент. Используя PMSF, мы приготовили гомогенные образцы, которые были стабильными в течение нескольких недель.Чтобы дополнить предыдущий анализ релаксации ЯМР и водородного обмена, мы первоначально использовали ЯМР-спектроскопию для отслеживания изменений химических сдвигов, вызванных температурой. Температурные коэффициенты амидных протонов, ¹ H ^N , чувствительны к наличию водородных связей. Таким образом, ¹ H ^N , которые участвуют в водородных связях, имеют d δ / dT более отрицательным, чем -4,6 частей на миллиард / ° C (Baxter & Williamson, 1997; Tomlinson & Williamson, 2012). В соответствии с этим, наименее отрицательные значения d δ / dT обнаруживаются в петлях и вблизи концов α -спиралей и β -нитей.Существует тенденция к тому, что значения d δ / dT на лицевой стороне белка вокруг активного сайта немного больше, чем на противоположной стороне, что позволяет предположить, что белок является наиболее гибким вокруг активного сайта (рис. 1). Помимо использования в качестве меры силы водородных связей, температурная зависимость химических сдвигов может также исследовать существование малонаселенных альтернативных состояний. Отклонение от линейности на графиках δ в зависимости от T может, таким образом, быть результатом температурно-зависимого сдвига в населении таких альтернативных состояний (Williamson, 2003; Tomlinson & Williamson, 2012).В Savinase большинство остатков демонстрируют линейную температурную зависимость химических сдвигов, но для 14 остатков наблюдается значительная ( F -тест, p <0,05), но небольшая кривизна на графиках δ в зависимости от T (Рис. S1 ). Однако эти остатки, очевидно, случайным образом разбросаны по белку. Температурное титрование ЯМР позволяет предположить, что савиназа наиболее гибкая вокруг активного сайта (рис. 1С), но не было идентифицировано никаких других альтернативных состояний.

Рисунок 1: Изменения химического сдвига в савиназе, вызванные температурой.

(A) ¹⁵ Спектры N-HSQC, записанные при 18 ° C, 22 ° C, 26 ° C, 30 ° C и 34 ° C в цветах от светлого до темно-красного. (B) Температурные коэффициенты химических сдвигов протонов амида основной цепи в зависимости от порядкового номера. Пунктирными линиями показаны средний температурный коэффициент (Avg) и одно стандартное отклонение (- σ ). (C) Структура Savinase имеет цветовую кодировку в соответствии с температурными коэффициентами, показанными на панели B. Цветовая шкала показана справа от структуры.Металлы показаны сферами: Ca ²⁺ (серый) и Na ⁺ (оранжевый). Каталитическая триада в активном центре показана сферами.

Для некоторых ферментов сообщалось, что конформационная динамика может быть ослаблена связыванием ингибиторов (Boehr et al., 2010; Masterson et al., 2012). Таким образом, мы обратились к HDX-MS, чтобы оценить, есть ли какие-либо изменения в локальной стабильности, когда савиназа ингибируется PMSF. Помимо необходимого небольшого количества белка, преимуществом HDX-MS является короткое время эксперимента.Таким образом, автопротеолиз неингибированной савиназы минимален, и можно сравнить картину HDX между активным и ингибированным ферментом.

Во-первых, общий общий HDX был измерен на образцах неингибированной и PMSF-ингибированной савиназы. HDX был очень медленным с 40% и 42% заменяемых атомов водорода, замененных дейтерием, соответственно, после 60 минут инкубации при pH 7 и 25 ° C, где обмен водорода благоприятен (рис. S2). Таким образом, у Savinase есть стабильное ядро, которое редко посещает открытое состояние, из которого может возникнуть HDX.Это согласуется с кристаллической структурой и тем, что можно было бы ожидать от водородного обмена, измеренного с помощью ЯМР на гомологичном субтилизине PB92 (Fogh et al., 1995).

Чтобы отнести HDX к разным областям, савиназу обрабатывали пепсином перед анализом MS. Эта обработка дала 110 пептидов, покрывающих 100% последовательности неингибированного фермента, и 106 пептидов, покрывающих 97% последовательности фермента, ингибируемого PMSF. Таким образом были созданы локальные профили HDX для неингибированной савиназы и PMSF-савиназы, покрывающие полную последовательность, за исключением остатков 209-216 в PMSF-савиназе (фиг.2). Разрешение данных HDX варьируется от единичных амидов до участков из 14 амидов. В некоторых частях последовательности обмен происходит в минутной шкале времени. Однако сегмент от остатка 123 до остатка 133, где несколько лабильных атомов водорода участвуют в водородных связях в структуре, почти полностью изменился в течение 15 с, что позволяет предположить, что эта часть белка является гибкой. С другой стороны, есть сегменты, которые практически не показывают обмена в течение 60 минут, что особенно заметно для сегментов 119–122 и 217–227.Как и ожидалось, большинство медленно обменивающихся областей включают остатки, участвующие во вторичных структурах внутри белка.

Рисунок 2: HDX-анализ Savinase.

(A – C) Зависимые от времени изменения содержания дейтерия для трех пептидных фрагментов, как указано в правом нижнем углу каждого графика. Данные для неингибированной и ингибированной савиназы показаны красным и синим цветом соответственно. Максимальное количество помеченных элементов управления показано черным. Планки погрешностей указывают стандартные отклонения для временных точек, измеренных в повторностях ( n = 3).(D – E) Обзор тепловой карты нормализованного локального HDX для различных регионов. Две карты предназначены для неингибированной савиназы (D) и ингибированной савиназы (E). Нормализованный HDX для четырех временных точек, указанных справа, отображается для каждого пептидного сегмента, экспериментально разрешенного по цветовой шкале от отсутствия HDX (синий) над белым до полного HDX (красный).

В целом, локальные профили HDX неингибированной савиназы и PMSF-савиназы (рис. 2 и рис. S3) очень похожи. Мы сравнили данные для двух ситуаций с помощью индивидуальных тестов t в каждый момент времени, чтобы определить, было ли поглощение дейтерия значительно различающимся.Результаты показывают, что только два незначительных различия были значительными ( p <0,01), и что они были отнесены к двум пептидным сегментам 147–168 и 184–190 / 191. Однако это снижение HDX при связывании PMSF было очень незначительным (рис. 2 и рис. S3) и граничило с нормальным пределом обнаружения / доверительным пределом метода (Trabjerg, Nazari & Rand, 2018; Hageman & Weis, 2019). Два сегмента 147-168 и 184-191 расположены пространственно близко друг к другу и к активному сайту и, таким образом, могут указывать на тонкое локальное влияние на динамику остова в этой области при связывании PMSF поблизости.

Таким образом, можно сделать вывод, что модификация савиназы с помощью PMSF имеет лишь незначительное влияние на динамику основной цепи, которая приводит к экспонированию амидных групп. Следовательно, наши эксперименты по ЯМР, проведенные на Савиназе, ингибированной ФМСФ, должны указывать на свойства неингибированного нативного состояния фермента. Мы отмечаем, что эксперименты HDX-MS были ограничены относительно короткими временными рамками из-за проблем с автопротеолизом фермента в более длительных временных масштабах. HDX, выполняемый в более длительных временных масштабах, потенциально может выявить различия между WT и PMSF-ингибированной савиназой, не обнаруженной здесь.

Затем мы записали независимые наборы данных дифракции рентгеновских лучей, записанные при комнатной температуре и при криогенной температуре. Было продемонстрировано, что криоусловия в некоторых случаях могут способствовать конформации, которые неблагоприятны при комнатной температуре (Halle, 2004), а в других случаях было продемонстрировано, что второстепенные конформации могут быть идентифицированы на картах электронной плотности высокого разрешения, записанных при комнатной температуре. которые не были обнаружены в криогенных данных (Fraser et al., 2009; Fraser et al., 2011). Савиназа была кристаллизована в пространственной группе P2 ₁ 2 ₁ 2 ₁ , и данные дифракции были собраны с разрешением 1,1 Å и 0,95 Å для RT и криогенных кристаллов соответственно. qFit и Ringer были использованы для построения мультиконформерных моделей савиназы как для RT, так и для криогенных кристаллов (Таблица S3). Структуры, полученные из кристаллов при комнатной и криогенной температурах, очень похожи, со среднеквадратичным отклонением между структурами 0,20 Å и 0,37 Å для основной цепи и всех тяжелых атомов, соответственно.Среднее смещение C ^α -C ^α выровненных структур составляет 0,18 Å, а наибольшее смещение составляет 0,80 Å. Таким образом, две структуры не показывают регионов с существенными различиями.

Из уточнения мультиконформеров мы находим альтернативные конформации для 28 остатков в структуре RT и для 25 остатков в криоструктуре (Таблица S4). Эти альтернативные конформации представляют собой ротамеры с разными боковыми цепями, за исключением пептидного сегмента 128-132, который в криоструктуре показывает альтернативную конформацию основной цепи (рис.3А). Большинство остатков с альтернативными ротамерами представляют собой серины (рис. 3B-3C), 14/28 и 12/25 в RT и криоструктурах, соответственно. За исключением пептидного сегмента 128-132 в криоструктуре и дипептида 103-104 в обеих структурах, остатки с альтернативными конформациями изолированы в структуре и, по-видимому, не участвуют в какой-либо кооперативной сети конформационных изменений.

Рисунок 3: Альтернативные конформации электронной плотности савиназы.

(A) Неоднородность основной цепи в криоданных пептидного сегмента 128–132 с картой электронной плотности 2mF _o -DF _c , построенной при 1 σ .Остатки 127 и 133, которые показывают только одну конформацию, также показаны на чертеже. (B) Рингер-анализ ротамеров Ser-215. Электронная плотность представлена ​​как функция двугранного угла боковой цепи × ₁ для данных RT (красный) и крио данных (синий). (C) Структура Ser-215 и окружающих остатков с картой электронной плотности 2mF _o -DF _c данных RT, нанесенной на 1 σ . Два ротамера боковой цепи Ser-215 с заселенностью 73% и 27% были смоделированы для электронной плотности.

Обсуждение

Мы продемонстрировали, что савиназа, за исключением альтернативных ротамерных состояний 25 боковых цепей, хорошо описывается единственной конформацией для структуры RT. В криоструктуре остатки 128–132 имеют альтернативную конформацию основной цепи, и этот сегмент также оказывается особенно гибким из анализа HDX-MS. Мы отмечаем, что этот сегмент примыкает к сегменту 125–128, который вместе с остатками 103 и 104, которые имеют альтернативные конформации как в RT, так и в криоструктурах, показал большую динамику, чем остаток белка из анализа релаксации ЯМР (Remerowski et al., 1996). Петли, выстилающие сайт связывания субстрата, имеют более отрицательные температурные коэффициенты химического сдвига, и даже более ясно, что эти части белка имеют самые большие кристаллографические B-факторы (рис. 4). B-факторы, температурные коэффициенты химических сдвигов и водородный обмен сообщают о движениях в белке в различных временных масштабах и, следовательно, имеют максимумы в разных областях белка. Это похоже на ситуацию с другими белками, где движения в разных временных масштабах наблюдаются в разных областях белков (Pandya et al., 2018; Verteramo et al., 2019).

Рисунок 4: Структура савиназы по кристаллографическим данным, собранным при комнатной температуре.

Ширина магистральной трассы масштабируется с помощью B-фактора. Цветовая шкала — от синего (0 Å ² ) над белым до красного (35 Å ² ). Остатки каталитической триады показаны в виде палочек.

Рентгеновские структуры позволяют предположить, что с помощью qFit и анализа Рингера савиназы мало что можно было получить из-за ее жесткости, возможно, за исключением легкого построения конформации 128-132 в криотемпературной структуре.Однако последнее не наблюдается в изоморфной криогенной структуре 4CFY уже в PDB. Альтернативные конформации боковых цепей, как правило, все были видны при обычном уточнении без qFit и анализа Рингера.

Из текущего исследования не удалось получить дополнительную информацию о структурной динамике, которая была предложена на основе предыдущих данных релаксации ЯМР и предполагала, что она включает конформационные изменения в миллисекундной временной шкале вокруг сайта связывания субстрата.Такие медленные конформационные изменения для многих ферментов были связаны либо со связыванием субстрата, либо с каталитическим механизмом, и мы сочли разумным предположить, что такие изменения конформации также будут присутствовать в савиназе, в частности, вокруг сайта связывания субстрата, как предполагает релаксация ЯМР (Remerowski и др., 1996). Однако отсутствие альтернативных конформаций согласуется с очень похожими конформациями гомолога субтилизина BPN ’с и без ингибитора протеина химотрипсина 2 (Gallagher et al., 1996; Радиски и Кошланд, 2002). Даже петли, покрывающие активный центр, имеют почти идентичную конформацию в этих двух структурах.

Внутренние микросекундно-миллисекундные движения, например, в аденилатциклазе, связаны с большими движениями петли, хотя конформационные изменения, например, в протеинтирозинфосфатазе 1B, РНКазе A и дигидрофолатредуктазе имеют меньшую амплитуду (Beach et al., 2005; Boehr et al. 2010; Whittier, Hengge & Loria, 2013). В совокупности эти колебания позволяют субстратам и продуктам получить доступ к активному участку или покинуть его.В этих ферментах конформационные изменения, необходимые для связывания и высвобождения субстрата и продукта, ограничивают скорость катализа. В савиназе активный сайт более доступен, и для связывания субстрата не требуется никаких существенных структурных изменений. Это поведение похоже на человеческий глутаредоксин (Jensen, Winther & Teilum, 2011) и может объяснить, почему не наблюдается конформационный обмен в основном состоянии савиназы, и предполагать, что связывание субстрата следует по механизму индуцированного соответствия.

Выводы

Наша цель состояла в том, чтобы оценить, приводит ли конформационная динамика, ранее наблюдаемая с помощью ЯМР-релаксации, к четко определенному минорному конформационному состоянию. Анализ кристаллографических данных qFit и Рингера не выявил значимых минорных конформаций в этой довольно жесткой структуре фермента. Другие применяемые методы также не выявили таких альтернативных состояний, хотя петли, окружающие активный сайт, обладают большей гибкостью, чем остальная часть белка.Однако очень малонаселенные конформации, которые требуют более чувствительных методов, таких как релаксация ЯМР (Kay, 2016) и FRET одиночных молекул (Hatzakis et al., 2012), конечно, все еще могут присутствовать.

Дополнительная информация

¹ H ^N Изменение химических сдвигов в зависимости от температуры

Показаны только данные для тех остатков, для которых химический сдвиг изменяется значительно лучше ( P <0,05, F тест), представленные полиномом второго порядка (сплошная линия), чем полиномом первого порядка (пунктирная линия). .

DOI: 10.7717 / peerj.9408 / supp-1

Глобальный водородный обмен в савиназе, измеренный с помощью MS

Содержание дейтерия относительно полностью дейтерированной савиназы нанесено на график для неингибированной (красный) и ингибированной (синий) савиназы. Планки погрешностей указывают на стандартные отклонения для временных точек, измеренных в двух экземплярах.

DOI: 10.7717 / peerj.9408 / supp-2

HDX-MS анализ савиназы

Зависимые от времени изменения содержания дейтерия для всех проанализированных пептидов.Данные для неингибированной и ингибированной савиназы показаны серым и красным цветом соответственно. Максимальное количество помеченных элементов управления показано черным. Планки погрешностей указывают стандартные отклонения для временных точек, измеренных в повторностях ( n = 3).

DOI: 10.7717 / peerj.9408 / supp-3 .